双链特异性 dna 酶 (dsDNase)

 

PCR是在研究和诊断中检测DNA存在的灵敏方法。PCR中使用的聚合酶经常被大肠杆菌  DNA 污染  。当靶向少量细菌DNA时，污染的DNA可能会导致灵敏度降低和假阳性。其他污染源可能是dNTP，缓冲液成分和引物/探针，以及在处理过程中引入的DNA。细菌的检测和分型可以通过使用针对保守区域（即16S或23S rDNA基因）的宽范围引物进行。该方法对细菌DNA污染非常敏感，在大多数预混液和聚合酶中都可以发现细菌DNA的痕迹。当使用qPCR检测或定量少量细菌DNA时，会污染  大肠杆菌 DNA可能导致假阳性结果。

双链特异性 dna 酶 (dsDNase)

• 双链 DNA 特异性核酸内切酶

• 热易灭活

• 引物无降解。

 

性质

dsDNase 是一种内切酶，可裂解 DNA 中的磷酸二酯键，产生具有 5’-磷酸和 3’-羟基末端的寡核苷酸。dsDNase 具有*的比活性，估计比牛 DNase I 高 30 倍，且不耐热。dsDNase 对双链 DNA (dsDNA) 有特别强的偏好性。在镁仅作为二价阳离子和使用寡核苷酸作为底物的情况下，对 dsDNA 的活性比对 ssDNA 的活性高 5000 倍。因此该酶可用于特异性降解 dsDNA，使 ssDNA 基本完整。

 

来源：在毕赤酵母中重组生产。

 

活性：dsDNase 在 20-40 ℃ 温度范围内具有高活性。至少需要 2.5 mm Mg

活性和宜 pH 值为 7.5。

 

热灭活：dsDNase 在 65 ℃ 孵育 15 min *灭活，不可逆灭活需要 1 mM DTT。

 

储存：-20 °C 条件下的短有效期为 2 年。4 °C 条件下可储存至少 6 个月。该酶还可耐受多次冻融循环。

 

纯度：dsDNase 纯化至表观均一性。

比活度：470 000 Kunitz 单位/mg。

 

单位定义：一个单位定义为 260 nm 处吸光度增加  0.001/min，在 50 mM 醋酸钠 pH 值中使用 50 mg/mL 高 MW DNA

5.0 和 5 mM MgCl2 (Kunitz,1950)。

 

“从 PCR 预混液中快速去除污染 DNA”

 

热灭活

0 5 10 15 20 25 30

时间 (min)

图 1：dsDNase 的残留活性。将 200µl 试验缓冲液中的 60U dsDNase 在 65 ℃ 下孵育。在时间间隔取出等份试样，并测定残留活性。

 

dsDNase 特异性

使用标记为 5'-的 FAM 和 3'-的 DarkQuencher® 的 15 聚寡核苷酸测定 dsDNase 对底物的特异性。荧光随时间的增加速率与酶活性成正比。在表 1 中，我们看到了 dsDNase 对双链和单链 DNA 和 RNA 寡核苷酸的相对活性。

 

dsDNase 对双链 DNA 具有高度特异性，使其他核酸不受损害。

 

PCR 预混液去污

大多数可用的 Taq 聚合酶被细菌 DNA 污染。这是基于 PCR 的细菌分型和检测中的一个问题，会产生假阳性结果。dsDNase 的*性质使其非常适合在加入 DNA 模板之前从 PCR 预混液中去除污染的 DNA。在图 2 中，我们用不同量的 dsDNase 处理了 PCR 主混合物，并使用广谱细菌 DNA 特异性引物检测主混合物中终污染的细菌 DNA。仅未处理的 PCR 主混合物

 

在非模板对照 qPCR 中给出阳性信号。

图 2：用 0、0.5、1 或 5U dsDNase 预孵育宜 PCR 缓冲液。所有 dsDNase 处理导致可扩增 DNA 的*去除。蓝线：未处理的反应混合物。

工作流程-PCR 预混液的去污

向 PCR 预混液中加入 dsDNase

孵育并灭活 37 ℃，15 min-65 ℃，15 min

添加模板 运行 PCR