dld-diagnostika 组胺 ELISA使用说明书

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dld-diagnostika 组胺 ELISA使用说明书

组胺 ELISA

酶免疫分析

用于定量测定血浆、尿液和细胞培养基中的组胺

 

 

参考

EA213/96

 

 

 

 

12 x 8

 

 

2 – 8 °C

his-e_6

dld-diagnostika 组胺 ELISA目录

 

 

 

1. 试验介绍和原理

2. 注意事项

3. 储存和稳定性

4. 试剂盒内容物

5. 标本采集和储存

6. 样品制备（酰化）

7. 检测方法 (ELISA)

8. 结果计算

9. 试验特征

10、文献

移液方案

 

 

 

1. 试验介绍和原理

 

组胺（β-咪唑-乙胺）是一种生物胺，是组氨酸代谢的产物。由组氨酸脱羧产生。

 

组胺广泛分布于哺乳动物组织中。它与肝素（非活性形式）结合并储存在嗜碱性白细胞和肥大细胞的颗粒中，并根据需要主动释放。这些细胞如果被附着在其膜上的 IgE 抗体致敏，当暴露于适当的抗原时发生脱颗粒。

组胺在过敏反应的初始阶段起主要作用。

变应原给药后血浆中组胺的定量具有临床意义。

 

组胺是对外来病原体免疫反应的一部分，它增加毛细血管对白细胞和  其他蛋白质，以便允许它们在受影响的组织中与外来入侵者接触。负责组织中组胺生物学效应的是不同表面受体的激活，例如 H1、H2 和 H3。

组胺参与调节肠道生理功能，并作为神经递质发挥作用。

 

竞争性组胺 ELISA 试剂盒使用微量滴定板形式。组胺与微量滴定板的固相结合。酰化组胺和固相结合组胺竞争固定数量的抗血清结合位点。当系统处于平衡状态时，通过洗涤除去游离抗原和游离抗原-抗血清复合物。通过抗兔/过氧化物酶检测与固相组胺结合的抗体。在 450 nm 处监测底物 TMB/过氧化物酶反应。与固相组胺结合的抗体量与样本中的组胺浓度成反比。

 

2. 注意事项

· 仅供体外诊断使用。

· 应使用一次性手套和护目镜。

  • 对本试剂盒中使用的所有人源试剂进行了 HIV I/II 抗体、HCV 和 HBsAg 检测，结果均为阴性。但是，由于没有任何试验方法可以*保证不存在传染性病原体，因此这些试剂应作为具有潜在生物危害性的材料进行处理。
  • 试剂盒制备中使用的动物源性材料来自经认证的健康动物，但这些材料应视为具有潜在传染性进行处理。

· 该试剂盒的某些组分含有有害试剂。这些组件标有适当的危险标签。

 

 

 

3. 储存和稳定性

到货后，在 2-8 °C 条件下储存试剂盒。一旦开封，试剂盒在失效日期前可保持稳定。有关制备试剂的稳定性，请参阅试剂制备。请勿使用超过试剂盒标签所示失效日期的组分。请勿在单次测定中混合任何试剂盒组分的不同批次。

 

 

 

 

4.

试剂盒内容物

 

4.1

MT 试纸条

试纸

12 条

 

各 8 个孔，用组胺预包被分开

 

 

4.2

标准品 1-6

校准品 1-6

6 瓶

 

每 4 mL，即用型

 

 

 

浓度：

 

 

 

标准

1

2

3

4

5

6

ng/ml

0

0.2

0.6

2

6

25

 

 

4.3 对照 1 和 2

每 4 mL，即用型范围：见 q.c. 证书

2 瓶

 

4.4 酰化缓冲液

6 mL，颜色代码为蓝色，即用型

 

4.5 酰化试剂冻干，将内容物溶于 1.5 mL 溶剂

1 瓶

 

 

3 瓶

 

 

 

4.6 溶剂

5.5 mL 溶剂溶解酰化试剂含丙酮，即用型

    警告              危险

4.7 抗血清

5.5 mL，即用型，颜色编码为黄色兔抗 N-酰基-组胺

1 瓶

 

 

 

 

1 瓶

 

 

 

4.8 酶结合物

12 mL，即用型

羊抗兔 IgG 过氧化物酶

       警告

1 瓶

 

 

 

4.9 清洗缓冲液

20 mL，50 倍浓缩

用蒸馏水将内容物稀释至 1 l 总体积

 

4.10 底物

12 mL TMB 溶液，即用型

 

4.11 终止液

12 mL，即用型

含 0.3 M 硫酸

 

4.12 反应板

用于酰化

 

4.13 平衡试剂

冻干，用蒸馏水溶解内容物，体积：见小瓶标签

1 瓶

 

 

 

1 瓶

 

 

1 瓶

 

 

 

2 个平板

 

 

1 瓶

 

需要但未提供的其他材料和设备：

 

· 20、30、50 和 100µl 移液器

· 回旋振荡器

· 多通道移液器或微孔板清洗装置

· 微孔板光度计 (450 nm)

· 蒸馏水

 

 

 

5. 标本采集和储存

 

可使用 EDTA 或肝素血浆、尿液和细胞培养基进行检测。

应避免样本反复冻融。

 

血浆

可使用 EDTA 或肝素血浆。不应使用溶血和脂血样本。

样品可在 2-8 °C 下储存长达 6 小时。对于更长时间的储存（长达 6 个月），样品必须在-20 °C 下冷冻。

 

尿液

本试验以及收集的尿液均可采用自发性尿液。在这种情况下，应收集 24 小时内排泄的尿液总量，并在含有 10-15 mL 6M 盐酸（作为防腐剂）的单个瓶中混合。避免暴露于阳光直射。测定总体积并取等份试样进行测量。对于疑似肾脏疾病的患者，也应检测肌酐浓度。尿样可在-20 ℃ 保存至少 6 个月。

尿样必须用蒸馏水以 1:15 稀释。测定前用水。

 

细胞培养基

试验中可使用 DMEM 和 RPMI 等培养基。用户必须检查其他媒体。

 

6. 试剂和样品制备

 

6.1. 试剂制备

 

 

清洗缓冲液

用蒸馏水稀释内容物。水的总体积为 1,000 mL。

稀释的清洗缓冲液必须在 2-8 ℃ 下储存长 4 周。在-20 ℃ 下冷冻储存更长时间。

 

 

平衡试剂

用蒸馏水溶解内容物。水（体积参见小瓶标签），短暂混合，置于滚筒混合器上至少 20 min。小心处理，以尽量减少泡沫形成。复溶后的平衡试剂应在-20 ℃ 下冷冻储存，并在小瓶标签上打印的失效日期前保持稳定。

 

 

 

酰化试剂

将一瓶内容物溶于 1.5 mL

 

并振摇 5 次

 

在定轨振荡器上运行分钟。酰化试剂必须在临用前制备。使用后，必须丢弃试剂。

第 2 个和第 3 个小瓶分别允许进行第 2 次和第 3 次运行检测。如果要在一次运行中使用整个试剂盒，建议合并三瓶酰化试剂的溶解内容物。

 

请注意，溶剂与许多塑料材料（包括塑料托盘）发生反应；溶剂不与正常移液器吸头和玻璃装置发生反应

溶剂易挥发，溶解的酰化试剂迅速蒸发。因此，请做不一起使用具有大表面的托盘  用多通道移液器移取酰化试剂。相反，使用 Eppendorf multipette（或类似器械），用溶解的酰化试剂直接从小瓶灌装注射器并逐孔加入。

 

 

所有其他试剂均为即用型。

 

6.2. 样品制备（酰化）

 

使试剂和样本达到室温。建议重复测定。

酰化反应板的孔只能使用一次。因此，使用前请标记各孔。

 

1. 各移取 50µl 标准品 1-6、50µl 对照品 1 和 2，

50µl EDTA 血浆样本，20 µl肝素血浆，50µl 尿液样本（用蒸馏水以 1:15 稀释。水）和 50µl 细胞培养基样品至反应板的相应孔中。

2. 移取各 50µl 酰化缓冲液至所有孔中。

3. 移取 50µl 蒸馏水。所有含有血浆样本的孔中均有水。

  • 分别移取 50µl 平衡试剂至含有标准品、对照品、尿样和细胞培养基的孔中  样品。分别移取 30µl 平衡试剂至含有肝素血浆的孔中。请勿移取至含有 EDTA 血浆样本的孔中。混合反应板 10 秒。
  • 分别移取 10µl 酰化试剂至所有孔中并继续  步骤 6。立即。颜色变为紫色。

请注意，溶剂与许多塑料材料（包括塑料托盘）发生反应；溶剂不与正常移液器吸头和玻璃装置发生反应

溶剂易挥发，溶解的酰化试剂迅速蒸发。因此，请做不使用具有大表面的托盘和多通道移液器移取酰化试剂。相反，使用 Eppendorf multipette（或类似器械），用溶解的酰化试剂直接从小瓶灌装注射器，并逐孔灌装。

  • 室温下在定轨振荡器上以中频孵育 15 min。做不盖住孔或板；在振荡器上保持板打开。

7. 移取 50µl 抗血清至所有孔中。

  • 室温下在定轨振荡器上以中频孵育 30 min。做不盖住孔或板；在振荡器上保持板打开。

 

每取 50µl 用于 ELISA。

 

7. 检测方法 (ELISA)

 

使试剂和样本达到室温。建议重复测定。

 

 

1. 分别移取 50µl 制备的标准品 1 至 6、对照品和样品，置于包被微量滴定条的相应孔中。

 

2. 室温 (20-25 ℃) 下在定轨振荡器上以中频孵育 60 min。

备选方案：手动短暂振摇微孔板，孵育 90 min，不得振摇。

 

  • 弃去或吸出孔内容物，分别加入 300µl 清洗缓冲液，再次弃去或吸出孔内容物。通过轻敲干净吸水纸上的倒置板去除残留液体。

重复洗涤程序 4 次。

 

4. 分别移取 100µl 酶结合物至所有孔中。

 

5. 室温下在定轨振荡器上以中频孵育 20 min。

备选方案：手动短暂振摇微孔板，孵育 25 min，不振摇

 

6. 清洗：重复步骤 3。

 

7. 吸取各 100µl 底物至所有孔中。

 

8. 室温 (20-25 °C) 下在定轨振荡器上以中频孵育 20±5 min。

备选方案：手动短暂振摇微孔板，孵育 20±5 min，不振摇

 

9. 移取各 100µl 终止液至所有孔中。

 

  • 在 15 min 内，在微孔板光度计中读取 450 nm（参考波长在 570-650 nm 之间）处的光密度。

 

8. 结果计算

 

在半对数曲线图上，标准品的浓度

（x 轴，对数）对其相应的光密度（y 轴，线性）作图。或者，各标准品和样品的光密度可与零标准品的光密度相关，以 OD/OD 比值表示大值然后绘制在 y 轴上。建议采用 4 参数迭代或三次样条进行评价。

对照品、血浆样品和细胞培养基的浓度可以使用其平均光密度直接从该标准曲线读取。

肝素血浆样本的读取浓度必须乘以因子 2.5。

尿液样本的读取浓度必须乘以因子 15。

 

转换：1 ng/mL 相当于 9.0 nmol/L

 

 

典型标准曲线：

 

 

 
 

 

 

 

9. 试验特征

 

9.1 正常值范围

 

 

参考范围

EDTA 血浆

< 1 ng/mL

肝素抗凝血浆

< 4.5 ng/mL

尿苷

< 45µg/天

 

以下给出的参考范围应仅作为指导原则。建议各实验室建立自己的正常值。

 

 

9.2 灵敏度

 

取零参比品吸光度的 2 倍标准偏差，从标准曲线读取相应值，确定检测下限。

 

 

灵敏度

EDTA 血浆

0.06 ng/mL

肝素抗凝血浆

0.15 ng/mL

尿苷

0.9 ng/mL

 

 

9.3. 特异性（交叉反应性）

 

检测结构相关组分对 ELISA 方法中使用的抗组胺抗血清的可能干扰。

 

物质

交叉反应性 (%)

组胺

100

1-甲基组胺

0.054

3-甲基组胺

0.13

1-甲基-4-咪唑乙酸

< 0.0001

咪唑-4-乙酸

< 0.0002

L-组氨酸

< 0.0001

 

9.4. 恢复

 

向各样品中加入递增量的组胺。分析各加标样品。采用理论预期值和实际测定值，估算不同浓度下组胺的分析回收率。

 

浓度 (ng/ml)

 

 

范围 (ng/ml)

平均值 (%)

范围 (%)

EDTA 血浆

0.6 – 13.4

101

93 – 111

肝素抗凝血浆

0.8 – 36.0

104

87 – 112

尿液

6.1 – 140.6

98

94 – 103

细胞培养基

1.0 – 12.9

104

91 – 121

 

 

9.5. 线性

 

使用样品的不同稀释液研究 ELISA 方法的线性。

 

浓度 (ng/ml)

 

 

范围 (ng/ml)

稀释度上限

平均值 (%)

范围 (%)

EDTA 血浆

0.5 – 10.0

1:20 平衡试剂

106

96 – 111

肝素抗凝血浆

0.9 – 13.7

1:15 平衡试剂

102

93 – 109

尿液

7 – 142

距离 1:20水

96

81 – 102

细胞培养基

1.1 – 10.3

距离 1:10水

106

99 – 111

 

 

9.6. 重现性

 

通过测定批内和批间变异系数 (cv)，研究 ELISA 方法的重现性。

 

浓度 (ng/ml)

 

 

范围 (ng/ml)

试验内 cv (%)

范围 (ng/ml)

试验间 cv (%)

EDTA 血浆

1.2 – 8.7

6.1 – 6.5

1.1 – 3.3

6.2 – 7.3

肝素抗凝血浆

2.5 – 11.8

6.3 – 5.0

2.1 – 10.8

8.9 – 4.4

尿苷

24.1 – 89.6

6.6 – 5.7

15.7 – 43.7

7.2 – 11.3

齐氏体

1.5 – 5.1

6.3 – 8.6

1.3 – 4.1

10.5 – 6.5

 

10. 文献

 

• Nettis,E.;Colanardi,A.;Ferrannini,A. (2005) :

抗组胺药作为调节炎症的重要工具

曲线中位数化学-抗炎药和抗过敏药, 4, 81-89

• 松本，J<unk>Matsuda,H.（2002 年）：

吡喹酮治疗日本血吸虫感染后肥大细胞依赖性组胺释放：对化疗相关不良反应的影响寄生虫研究 88:888–893

• Belic,A.;Grabnar,I.;Karba,R.;et al.(1999)：

组胺和甲基组胺动力学的相互依赖性：建模和模拟方法

生物学和医学计算机 29，361-375

• Martens-Lobenhoffer,J.;Neumann,H. (1999) :

人尿中 1-甲基组胺和 1-甲基咪唑乙酸测定作为肥大细胞增多症诊断工具

色谱学报 B，721，135-140

• Prell,G.;Green,J.;Elkashef,A. (1996) :

精神分裂症患者尿液排泄与脑脊液中生物胺及其代谢产物的关系

精神分裂症研究 19，171-176

• Eberlein-König,B.;Ullmann,S.;Thomas,P.;et al.(1995)：

蜂毒过敏患者在脱敏治疗成功或失败后因刺痛激发导致的类胰蛋白酶和组胺释放

临床和实验过敏，第 25 卷，第 704-712 页

• Koller,D.;Rosenkranz,A.;Pirker,C.;.等人(1992)：

青霉素致敏患者全血嗜碱性粒细胞释放组胺的研究

过敏：47:459-462。

• Marquardt,D.;Wasserman,S. (1982) :

肥大细胞在过敏性疾病和肥大细胞增多症中的作用

West JMed;137:195-212

• Butchers,P.;Vardey,C.;Skidmore,I.;et al.(1980)：

猕猴支气管灌洗的含组胺细胞。过敏性组胺释放的时间进程和抑制

Archs Allergy appl.免疫。62:205-212

 

移液方案样品制备

 

 

标准品

对照

EDTA

血浆

肝素抗凝血浆

尿液（稀释）

中号

标准品 1-6

µl

50

 

 

 

 

 

对照 1 和 2

µl

 

50

 

 

 

 

EDTA 血浆

µl

 

 

50

 

 

 

肝素抗凝血浆

µl

 

 

 

20

 

 

尿液（1:15 稀释）

µl

 

 

 

 

50

 

中号

µl

 

 

 

 

 

50

酰基。缓冲液

µl

50

50

50

50

50

50

距离水

µl

 

 

50

50

 

 

平衡试剂

µl

50

50

 

30

50

50

振摇 10 秒

 

酰基。试剂 µl

10

10

10

10

10

10

立即室温下振摇 15 min，保持平板打开

 

抗血清 µl

50

50

50

50

50

50

室温下振摇 30 min，留板，每取 50µl 用于 ELISA

 

ELISA 移液方案

 

 

标准品

对照

样本

标准品 1-6 µl

50

 

 

对照 1 和 2 µl

 

50

 

酰基。样本 µl

 

 

50

室温下振摇 60 min4 次清洗

酶结合物 µl

100

100

100

室温下振摇 20 min4 次清洗

底物 µl

100

100

100

室温下振摇 15-25 min

 

终止液 µl

100

100

100

450 nm 处吸光度读数