JC-1线粒体膜电位检测试剂盒说明书

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使用方法

使用方法

1. JC-1染色工作液的配制：

取适量JC-1 (200X)，按照每5µl +995 μl JC-1缓冲稀释液（1X）的比例稀释至1X JC-1染色工作液。

注：试剂盒标配JC-1缓冲稀释液为10X，使用前用三蒸水稀释至1X使用，配置前应于37℃水浴至室温后方可使用，以免稀释液过冷染色过程对细胞有刺激影响实验结果，稀释时将JC-1缓冲稀释液（1X）快速加入到200X的JC-1母液中稀释效果更佳。一般建议6孔板每孔使用JC-1染色工作液量为1ml，其它培养器皿用量以此类推。对于细胞悬液每5-10*10⁶细胞加0.5ml JC-1染色工作液（1X）。

2. 阳性对照组：

该试剂盒包含阳性对照CCCP（10 mM），CCCP可以诱导细胞线粒体膜电位变化。使用方法：用细胞培养液配制CCCP，推荐终浓度为10 µM，对于不同细胞CCCP浓度可自行调整。正常条件下，10 µM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会明显改变，此时，JC-1染色后可观察到明显的绿色荧光；相反，正常的细胞经JC-1染色后显示红色荧光。

3. 悬浮细胞处置：

a) 取5-10*10⁶细胞，用0.5 ml细胞培养液重悬细胞。

b)加入0.5 ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。置于细胞培养箱中37℃孵育20-30分钟；不同细胞根据实验可自行调整染色时间。

b) 孵育结束后，700g 4℃离心，收取沉淀细胞。

c) 用JC-1缓冲稀释液（1X）洗涤2-3次：加入1 ml JC-1染色工作液重悬细胞，随后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可用流式细胞仪分析。

4. 贴壁细胞处置：

a) 6孔板贴壁细胞处理过程如下：首先，弃培养液，用常温PBS或培养液轻洗细胞2次，加入1 ml新鲜细胞培养液。阳性对照组中加入CCCP（终浓度10 µM）提前置于孵箱中处理20-30分钟；

b) 随后，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混匀。置于培养箱中37℃孵育30-60分钟不等（可根据实验情况调整）。

d)  孵育结束后，弃上清，用JC-1缓冲稀释液（1X）洗涤细胞2次。

e)  加入1 ml细胞培养液，于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5. 纯化的线粒体：

a) 1 ml染色体系包含：0.9 ml JC-1染色工作液+0.1 ml纯化的线粒体 (10-100µg)；置于37℃孵育20-30 分钟，期间可上下颠倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育结束后，可用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：荧光分光光度计检测：激发波长为485 nm，发射波长为590 nm。荧光酶标仪检测时，激发波长可在475-520 nm范围内设置。具体可参考步骤6中的条件进行荧光检测。

c) 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同步骤6。

6. 荧光检测与数据分析：

JC-1单体的激发波为490 nm，发射光波长为530 nm；JC-1聚合物，激发波长为525 nm，发射波长为590 nm。实际测试过程中，可依据实验室仪器的相关参数进行设置，不必把激发和发射波长设置在最大激发波长和最大发射波长。荧光显微镜或共聚焦观察时，JC-1单体的检测可参照其它绿色荧光时的设置，如GFP或FITC通道；同理，JC-1聚合物的检测时可以参考其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3的设置。因此，出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，我们可以通过比较红绿荧光的相对比例衡量线粒体膜电位的变化。

注意事项

1.  JC-1 (200X)母液使用时需等待全部溶解后使用。

2. JC-1缓冲稀释液使用时须0.2μm滤膜进行无菌处理，以防微生物污染影响染色效果。

3. 洗涤时也可以用Hanks' Balanced Salt Solution、PBS等替代JC-1缓冲稀释液。

附录：

 

 

图1. 使用本试剂盒检测A549细胞在正常和造模前后的线粒体膜电位的实验效果图。

正常A549细胞经JC-1染色后以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光很弱；使用CCCP（10 μM）诱导使线粒体膜电位下降后，JC-1以单体存在形式居多，因此线粒体内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强。

4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5.本产品主要用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

 

运输及保存方法

JC-1 (200X)母液需 -20℃避光保存，避免反复冻融。JC-1缓冲稀释液4℃保存，至少2周内有效。