线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1))说明书

产品详情

 

产品描述

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用 JC-1 作为膜电位识别的荧光探针，能够快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，用于早期的细胞凋亡检测。

JC-1 是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其检测原理为：当 JC-1 进入细胞后，正常细胞中线粒体膜电位较高，在此条件下 JC-1 会聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，进而产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中， 此时 JC-1 以单体存在，产生绿色荧光。实际使用过程中，我们通常通过比较红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的程度，方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变，可以很快速地捕捉到细胞膜电位的下降；同时红色到绿色荧光的转变，也可以作为细胞凋亡早期的一个检测指标。JC-1 单体的最大激发波长为 515nm，最大发射波长为 529nm；JC-1 聚合物的最大激发波长为585nm，最大发射波长为 590nm。观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。本试剂盒提供 CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品组成

包装清单：

 

使用本试剂盒检测 A549 细胞在正常和造模前后的线粒体膜电位的效果图。正常 A549 细胞经 JC-1 染色后以聚合物形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光很弱；使用 CCCP（10μM）诱导使线粒体膜电位下降后，JC-1 以单体存在形式居多，因此线粒体内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强。

运输与保存

-20℃避光保存，避免反复冻融。JC-1缓冲稀释液4℃保存，至少2周内有效。

实验步骤

1. JC-1 染色工作液的配制：

取适量 JC-1 (200X)，按照每 5µl +995 μl JC-1 缓冲稀释液（1X）的比例稀释至 1X JC-1 染色工作液。 注：试剂盒标配 JC-1 缓冲稀释液为 10X，使用前用三蒸水稀释至 1X 使用，配置前应于 37℃水浴至室温后方可使用，以免稀释液过冷染色过程对细胞有刺激影响实验结果，稀释时将JC-1 缓冲稀释液（1X）快速加入到 200X 的 JC-1 母液中稀释效果更佳。一般建议 6 孔板每孔使用 JC-1 染色工作液量为 1ml，其它培养器皿用量以此类推。对于细胞悬液每 5-10*106 细胞加 0.5ml JC-1 染色工作液（1X）。

2. 阳性对照组：

该试剂盒包含阳性对照 CCCP（10 mM），CCCP 可以诱导细胞线粒体膜电位变化。使用方法：用细胞培养液配制 CCCP，推荐终浓度为 10 µM，对于不同细胞 CCCP 浓度可自行调整。正常条件下，10 µM CCCP处理 20 分钟后线粒体的膜电位会明显改变，此时，JC-1 染色后可观察到明显的绿色荧光；相反，正常的细胞经 JC-1 染色后显示红色荧光。

3. 悬浮细胞处置：

a) 取5-10*106细胞，用0.5ml 细胞培养液重悬细胞。

b) 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。置于细胞培养箱中37℃孵育20-30分钟；不同细胞根据实验可自行调整染色时间。

b) 孵育结束后，700g 4℃离心，收取沉淀细胞。

c) 用JC-1 缓冲稀释液（1X）洗涤 2-3 次：加入 1 ml JC-1 染色工作液重悬细胞，随后用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可用流式细胞仪分析。

4. 贴壁细胞处置：

a) 6 孔板贴壁细胞处理过程如下：首先，弃培养液，用常温 PBS 或培养液轻洗细胞2次，加入1ml新鲜细胞培养液。阳性对照组中加入CCCP（终浓度 10 µM）提前置于孵箱中处理20-30分钟；

 

b) 随后，加入1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。置于培养箱中 37℃孵育30-60分钟不等（可根据实验情况调整）。

d) 孵育结束后，弃上清，用 JC-1 缓冲稀释液（1X）洗涤细胞 2 次。

e) 加入 1 ml 细胞培养液，于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5. 纯化的线粒体：

a) 1 ml 染色体系包含：0.9 ml JC-1 染色工作液+0.1ml纯化的线粒体 (10-100µg)；置于37℃孵育 20-30 分钟，期间可上下颠倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育结束后，可用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：荧光分光光度计检测：激发波长为485nm，发射波长为 590 nm。荧光酶标仪检测时，激发波长可在 475-520 nm 范围内设置。具体可参考步骤6中的条件进行荧光检测。

c) 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同步骤6。

6. 荧光检测与数据分析：

JC-1 单体的激发波为 490 nm，发射光波长为 530 nm；JC-1 聚合物，激发波长为 525 nm，发射波长为

590 nm。实际测试过程中，可依据实验室仪器的相关参数进行设置，不必把激发和发射波长设置在最大激发波长和最大发射波长。荧光显微镜或共聚焦观察时，JC-1 单体的检测可参照其它绿色荧光时的设置，如GFP 或 FITC 通道；同理，JC-1 聚合物的检测时可以参考其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 的设置。因此， 出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，我们可以通过比较红绿荧光的相对比例衡量线粒体膜电位的变化。

注意事项

8. 注意事项：

a) JC-1 探针母液（A 试液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。

b) JC-1  缓冲稀释液（B 试液）：如需无菌操作，使用前可用 0.2μm 滤膜过滤后装瓶使用即可。4℃保存，至少2周内有效。

  c) CCCP（C 试液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；尽量减少反复冻融。洗涤时也可以用 Hanks' Balanced Salt Solution、PBS 等替代JC-1 缓冲稀释液。