worthington磷酸酶

磷酸酶，碱性测定

分析（鸡肠酶）

方法：磷酸酶活性的测定是基于Brandenberger和Hanson（1953）和Hofstee（1954）的工作。确定了该酶对邻羧基苯基磷酸酯的初始水解速率的催化作用。与磷酸酯不同，水杨酸大吸收约300 nm的光。因此水解率可以通过吸光度的增加来确定。在规定的条件下，一个单元在25°C和pH 8.8下每分钟水解一微摩尔的邻羧基苯基磷酸酯。

试剂种类

• 0.1 M Tris·HCl，pH 8.5
• 0.2 M甘氨酸，pH 8.8
• 0.05 M氯化镁
• 3.65 mM邻羧基磷酸苯酯（OCPP）

酵素

以1 mg / ml的浓度溶于0.1 M Tris-HCl，pH 8.5（原液）中。活化后可能需要进一步稀释。

程序

通过在25°C水浴中将mg / ml溶液孵育20-30分钟来激活酶。

将分光光度计调节至300 nm和25°C。

移液到每个比色皿中，如下所示：

 

0.2 M甘氨酸，pH 8.8	2.0毫升
3.65毫米OCPP	1.0毫升
0.05 M氯化镁2	0.5毫升

 

在分光光度计中于25°C孵育3-4分钟，以达到温度平衡并确定空白速率（如果有）。加入0.1 ml的原液并记录从曲线的初始线性部分增加A / ₃₀₀。

计算方式

分析（大肠杆菌酶）

方法：该方法是Garen和Levinthal（1960）的方法，其中通过测量由对硝基苯基磷酸酯水解为对硝基苯酚而导致的410 nm吸光度的增加来确定反应速度。在规定的条件下，一个单元在25℃，pH 8下每分钟释放一微摩尔对硝基苯酚。

试剂种类

• 1.5 MTris⋅HCl缓冲液，pH 8.0
• 0.003 M对硝基苯基磷酸酯（PNP）。必须谨慎使用分析级和正确的分子量。

酵素

在试剂级水中稀释，以获得0.02-0.04ΔA/分钟的速率。

程序

将分光光度计调节至410 nm和25°C。

移液到每个比色皿中，如下所示：

 

PNP 0.003百万	1.0毫升
1.5 M Tris·HCl，pH 8.0	2.0毫升

 

充分混合并在分光光度计中孵育4-5分钟，以达到温度平衡并确定空白率（如果有）。加入0.1毫升稀释的酶并记录。从曲线的线性部分确定3-5分钟的A ₄₁₀。

计算方式

分析（小肠酶）

方法：在37°C，pH 9.8下，每分钟可水解1 umole的对硝基苯酚磷酸酯。

试剂种类

• 1.0 M二乙醇胺和0.05 mM MgCl ₂缓冲液，pH 9.8：用试剂级水稀释12.4 gm二乙醇胺（85％）。加入0.05 ml MgCl ₂溶液（见下文），并用HCl将pH调节至9.8（在37°C下）。用试剂级的水调节至100 ml。
• MgCl ₂溶液：将20.3 g MgCl2°6 H2O溶于100 ml试剂级的水中。
• 0.67 M磷酸对硝基苯酯溶液：将250 mg磷酸对硝基苯酯钠盐溶于1.0 ml试剂级的水中。
• 稀释剂：0.1 M TEA·HCl。将1.86克TEA·HCl溶于试剂级的水中，添加0.1毫升MgCl ₂溶液和0.1毫升0.1 M ZnCl ₂，用NaOH调节pH到7.6，然后用试剂级的水调节到100毫升。

酵素

使用稀释剂获得大约0.05-0.06 u / ml。在室温下静置15-20分钟。

程序

将分光光度计调节至405 nm和37°C。

移液到试管中：

 

	测试	空白
缓冲	3.00毫升	3.00毫升
磷酸4-硝基苯酯	0.050毫升	0.050毫升
混合并保温以达到温度平衡。
冲淡	——	0.050毫升
样品	0.050毫升	——

 

混合。测量吸光度的变化，并根据曲线的线性范围计算ΔA/ min。

计算方式