fivephoton hBACE1-ELISA
人 BACE1试剂盒
部件编号hBACE1-ELISA
ELISA
仅用于研究。不适用于诊断应用。
储存：4oC，到达后 6 个月
安全性：终止液含有酸。避免眼睛和皮肤接触标准肽浓度：225 pg/mL
分析范围：5-200 pg/mL 灵敏度：2.5 pg/mL
实验原理
试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定 BACE1 浓度。将样品应用于预先包被亲和纯化的多克隆抗 BACE1 抗体的微量 elisa 微孔中。孵育样品，然后清洗。加入第二种山羊抗 BACE1-HRP 结合物抗体，然后孵育并清洗。加入显色液 A 和 B，导致颜色变为蓝色。应用终止液终止反应，使溶液变为黄色。采用与标准肽浓度对应的 450 nm 处的吸光度读数测定样品中 BACE1 的浓度。
由于 BACE1 是在分泌途径（包括内质网、高尔基体和质膜 1）中加工的跨膜蛋白，其从细胞中提取和 ELISA 试验中检测的主要方法涉及使用非变性去污剂缓冲液通过细胞裂解和溶解进行制备。还在生物体液（如 CSF 2）中检测到 BACE1：根据您计划测定的组分，按照以下所述制备样本。请注意，说明 7 与膜包埋部分相关。
参考文献：
1、颜氏等。等人《生物化学杂志》2001 年 9 月 28 日；276 (39) :36788-96。电子版 2001 年 7 月 20 日。
2. Zetterberg H 等。Arch Neurol.2008 Aug;65 (8) :1102-7.
样品制备：以下作为样品制备的通用指南。研究应进行部门内文献分析，以确定制备样品的宜方法。
1. 血清：室温下凝固 10-20 min。以 2000-3000 rpm 离心 20 min。
收集上清液进行测定。如果出现沉淀，再次离心。测定上清液部分。
2. 血浆：使用适当的 EDTA 或肝素作为抗凝剂。使用搅拌棒混合 10-20 min。以 2000-3000 rpm 离心 20 min。收集上清液。如果出现沉淀，再次离心。
3. 尿液：收集于无菌容器中。以 2000-3000 rpm 离心 20 min。收集上清，如出现沉淀，再次离心。收集上清液进行测定。
4. 细胞培养上清液：分泌成分检测：培养液以 2000-3000 rpm 离心 20 min。收集上清液进行测定。
- 细胞浆：用 PBS (pH7.2-7.4) 将细胞悬液稀释至细胞浓度为 100 万个/ml。进行反复冻融循环，使细胞膜断裂并释放细胞内成分。以 2000-3000 rpm 离心 20 min。收集上清液进行测定。如果出现沉淀，再次离心并测定
上清液。
- 组织（细胞质成分）：切割组织切片并称重。在 PBS (pH7.2-7.4) 中加入切片。用液氮快速冷冻。将样品解冻至 2-8 ℃，加入 PBS 并均质化。以 2000-3000 rpm 离心 20 min。除去上清液。
7. 细胞和组织匀浆和裂解物：使用非变性去污剂蛋白提取试剂（例如，FIVEphoton Biochemicals 部件号ELSP-1）在冰上存在蛋白酶抑制剂的情况下匀浆组织/和裂解细胞。离心细胞碎片，并使用上清液进行 ELISA 试验。
8. 样本可在-80 ℃ 下储存。避免反复冻融循环。您可以将样本等分用于随后的 ELISA 测定。
9. 避免含有 SDS 的变性细胞裂解缓冲液如 RIPA 缓冲液。
表 1. 试剂盒包含的材料。在 4 ℃ 下储存所有材料
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1 |
标准肽 |
0.5ml |
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7 |
显色液 A |
6ml |
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2 |
标准稀释液 |
1.5 ml |
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8 |
显色液 B |
6ml |
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3 |
Microelisa 板条 |
12 孔 ×8 条 |
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9 |
终止液 |
6ml |
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4 |
HRP 结合物-检测抗体 |
6 ml |
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10 |
指导手册 |
1 |
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5 |
30× 清洗液 |
20ml |
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11 |
密封袋 |
1 |
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6 |
样品稀释剂 |
6ml |
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需要但未提供的材料
1. 37oC 培养箱
2. 标准吸光度酶标仪
3. 精密移液器和一次性移液器枪头
4. 去离子水
5. 一次性样本稀释管
6. 吸水纸
7. 转移至 ELISA 皿前，用于制备溶液的 96 孔板
8. 96 通道移液管
试验的重要注意事项和准备
1. 实验者应进行初步试验，以确定符合试验范围的样品稀释液。使用本试剂盒测定范围内的低和高浓度的标准肽，对您的样本进行初步测定。用“样品稀释剂（表 1，组分 6）”混悬并稀释实验样品，以符合测定范围（或者，用含有蛋白质阻断剂（例如 0.25% 酪蛋白）的 PBS 稀释样品）。可能需要对多个样本进行系列稀释，以确定符合测定范围的正确样本浓度。如果需要调整，浓缩或稀释实验样品。留出足够的实验样品留样，用于重复试验。
2. 通过仅进行溶剂对照，确定溶剂缓冲液是否无意中与试验发生交叉反应并产生颜色变化。此外，通过在溶剂中稀释提供的标准肽，确定溶剂缓冲液中的成分是否抑制测定反应，并进行测定试验。将结果与样品稀释剂中的相同标准肽稀释液进行比较（表 1，组分 6）。为了补救，在
“样品稀释剂”（表 1，组分 6）或在另一种溶剂（如 PBS）中制备样品，以防止意外的实验读数或试验失活。
- 进行测定前，应将试剂盒平衡至室温 30 min。将打开的 microelisa 板保存在密封的塑料袋中，4 ℃ 保存。推荐使用多通道移液器同时点样。试验期间应密封平板。不应使微孔干燥。
4. 在单独的试管或 96 孔板中制备标准品和样品，而不是在 ELISA 板孔中。将标准品和样品同时转移至 ELISA 板中。
5. 建议对样本进行一式两份分析，以解决移液错误。
6. 使用新的加样枪头和 ELISA 板密封剂，以避免交叉污染。
7. 请勿混合其他 ELISA 试剂盒中的试剂。
8. 避免 ELISA 板底部和侧面出现指纹、污迹、划痕、气泡或液滴。
9. 请注意，未被冲洗掉的样本中的叠氮化纳可能会抑制产生测定颜色反应的辣根过氧化物酶 (HRP)。
10. 当根据含量测定计算样品浓度时，应考虑稀释因子。
11. 如果清洗液在 4 ℃ 下储存期间结晶，则在 37 ℃ 下加热溶液并振摇直至结晶混悬。
试验程序
标准品和样品制备。标准品和样品应同时加入孔中。在单独的 96 孔板中制备标准品和样品，并同时转移至 ELISA 板中。不得在 ELISA 板中制备溶液。
检测方法
- 留出 12 个孔，标记用于标准肽稀释液。如下表 2 所示，一式两份配置 6 个浓度的标准肽。切勿直接使用 ELISA 孔进行稀释。各孔的终总体积应为 50 l。
表 2. 标准品稀释液该稀释系列用于 225 pg/mL 标准肽。
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孔 |
标准品浓度 |
标准编号 |
稀释说明 |
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1 |
150 pg/mL |
1 |
将 100 μL 标准肽（表 1，组分 1）与 50 μL 标准稀释剂（表 1，组分 2）混合。移取 100 μL，制备标准品 3。 |
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2 |
150 pg/mL |
2 |
将 100 μL 标准肽与 50 μL 标准稀释剂混合。移取 100 μL，制备标准品 4。 |
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3 |
100 pg/mL |
3 |
将 100 l1 号标准品与 50 μL 标准品稀释剂混合。取出 100 l，制备标准品 5。 |
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4 |
100 pg/mL |
4 |
将 100 l2 号标准品与 50 μL 标准品稀释剂混合。取出 100 l，制备标准品 6。 |
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5 |
50 pg/mL |
5 |
将 100 l3 号标准品与 100μl 标准品稀释剂混合。取出 100 l 制成 标准品 7. 取出 50 l，弃去。 |
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6 |
50 pg/mL |
6 |
将 100 l4 号标准品与 100μl 标准品稀释剂混合。取 100 l，制成标准品 8。取 50 l，弃去。 |
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7 |
25 pg/mL |
7 |
将 100 l5 号标准品与 100 μL 标准品稀释剂混合。取出 100 l 制成 标准品 9. 取出 50 l，弃去。 |
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8 |
25 pg/mL |
8 |
将 100 l6 号标准品与 100 μL 标准品稀释剂混合。取出 100 l，制备标准品 10。取下 50 l，弃去。 |
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9 |
12.5 pg/mL |
9 |
将 100 l7 号标准品与 100 μL 标准品稀释剂混合。取出 50 l，制成 标准 11。取下 100 l，弃去。 |
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10 |
12.5 pg/mL |
10 |
将 100 l8 号标准品与 100 μL 标准品稀释剂混合。取出 50 l，制备标准品 12。取下 100 l，弃去。 |
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11 |
6.2 pg/mL |
11 |
将 50 l9 号标准品与 50 μL 标准品稀释剂混合。取 50 l，制备标准品溶液。 |
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12 |
6.2 pg/mL |
12 |
将 50 l10 号标准品与 50 μL 标准品稀释剂混合。取出 50 l，制备标准品溶液 |
2. 空白、标准品和样品制备：（在单独的多孔培养皿中预混合溶液，并将溶液同时转移至 ELISA 培养皿中。不得在 ELISA 皿中预混合溶液）。
a) 空白孔：设置两个“空白孔”：“重现样品溶剂（不含样品）相对于空白溶液中样品稀释剂的比例。空白溶液重现了不含抗原的样品溶液的含量。对于每个空白孔，制备 50 μL 混合的“空白溶液”。
b) 标准品溶液孔：在各稀释度下制备 50 μL 标准品。
c) 样品孔：对于每个孔，制备 50 μL 样品（可能已经预先稀释以满足测定范围）。
d) 同时将空白、标准品和样品分配到 ELISA 试纸条中。
e) 立即分配 50 μL HRP 结合物检测抗体溶液（组分 4 表
1) 至各孔。然后用封闭膜覆盖微孔板。
f) 在 37 ℃ 培养箱中轻轻混合 30 min。
3. 孵育期间，制备清洗液：用 dH20 将 30 倍清洗液稀释至 1 倍。每孔制备 600 μL 1X 清洗液。
4. 清洗：小心移除密封件膜：请勿交叉污染液体。轻轻抽吸
去除每个孔中的液体。翻转平板并在吸水纸上拍干。加入 100 μL 清洗液
溶液并在抽吸前在孔中渗滤 3 min。轻轻旋转酶标板。重复清洗步骤 5 次，清洗 30 秒。因此，每孔总共需要 600 μL 清洗液。也可以使用自动清洗器清洗 ELISA 孔。吸干微孔板，但不允许微孔干燥。
5. 显色：每孔先同时加显色液 A 50 μL，再每孔同时加显色液 B 50 μL。轻轻混合溶液 A 和 B。将平板在 37 ℃ 下避光孵育 10 min。
6. 终止：每孔加入 50 μL 终止液终止反应（蓝色变为黄色）。佩戴护目镜：终止液含有酸。
- 在加终止液 10 min 内，在 450 nm 处读取样品：设空白孔为零，测定各孔在 450 nm 处的吸光度 (OD)。
数据分析
1. 用空白标准溶液和相应的 OD 值绘制标准曲线。您可能希望计算线性回归方程，以确定您样本的浓度。请记住，在终计算中，样品在试验中稀释了 5 倍。用于计算样品浓度的其他数据分析方法也适用。
程序流程图
制备标准品、空白和样品
向孔中加入样品和 HPR 检测抗体结合物，在 37 ℃ 下室温孵育 30 min。
每孔洗涤 6 次
加入显色液 A 和 B，37 ℃，10 min，暗处
加入终止液