PEI转染的方法

PEI转染的方法

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(*转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

PEI转染的方法
材料:质粒DNA  指数生长的真核细胞    PEI (聚乙烯亚胺,是线性的)  1×HBS (pH7.4)
配方:  PEI 储存液(100 μM):称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS (pH7.4)
中, 0.2 μm 滤膜过滤,储存于4℃备用。
1×HBS (pH7.4): 将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水,加入20 ml 1 M 的
HEPES,调pH 值到7.4,定容至1 L,过滤(0.2 μm 滤膜)后储存于4℃备用。
方法:
1.细胞分盘: 通过胰酶消化收集细胞,用适当的*培养基以4×105 至8×105
细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上(根据实验需要选择培养皿,
使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90%)。根据细胞贴壁情况于
含5% CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁*后即可开始转染。转染
前换入2 mL 预热的无血清培养基。
2. 制备PEI-DNA 混合物:以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准
备两支1.5 mL 离心管,一管将质粒DNA(总量2-8 μg 为佳)加入240 μL HBS
中,混匀。另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM,充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中,充分混匀后
室温静置20-30 min。zui后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层
细胞的细胞培养基中,轻轻摇动平皿混匀,置于含5%~7% CO2 的37℃ 温箱
孵育。
注:每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀,保证所取的
浓度一致。
3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基,继续培养,16 h 左右
可以观测到报告基因的表达。

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