arcticzymes尿嘧啶-DNA糖基化酶
Cod Uracil-DNA Glycosylase
鳕鱼尿嘧啶-DNA糖基化酶
来自Atlantic Cod的Cod Uracil-DNA糖基化酶（Cod UNG）是仅有可商购的UNG酶，其通过适度热处理*且不可逆地灭活。该酶在含有修饰的Cod UNG基因的重组大肠杆菌（ung-）菌株中产生。
Cod UNG酶的主要优点
- 热不稳定
- 在55°C时*不可逆地灭活
- 使用Cod UNG可在RT-PCR中实现污染控制
- PCR后不会降解PCR产物。这使得PCR产物的下游使用成为可能
- 高纯度酶，无污染核酸酶测试
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Product information |
Article no. |
Notes |
Price |
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Cod UNG – Pack size: 100 U quantity |
Pack size: 100 UConc.: 1U/µl |
#70500-201 |
€92 |
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Cod UNG Triton FREE – Pack size: 100 U quantity |
Triton FREE |
#70501-201 |
€92 |
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Cod UNG – Pack size: 1000 U quantity |
Pack size: 1000 UConc.: 1U/µl |
#70500-202 |
€390 |
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Cod UNG Triton FREE – Pack size: 1000 U quantity |
Triton FREE |
#70501-202 |
€390 |
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N/A |
Pack size: 50 kUConc.: 50U/µl |
#70500-150 |
REQUEST QUOTE |
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N/A |
Pack size: 50 kUConc.: 1U/µl |
#70500-151 |
REQUEST QUOTE |
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N/A |
Glycerol-free |
#70510-105 |
REQUEST QUOTE |
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N/A |
Glycerol-free |
#70510-150 |
REQUEST QUOTE |
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N/A |
Pack size: 200 kUConc.: 50U/µl |
#70500-160 |
REQUEST QUOTE |
PCR携带预防
关于PCR预防的一般信息
PCR的高灵敏度，特别是qPCR，使得该方法易于污染，产生错误或不准确的结果。来自先前PCR的携带污染物被认为是假阳性结果的主要来源之一。由于气溶胶，污染移液管，表面，手套和试剂，污染物可能从先前的扩增反应中带走。
在扩增DNA和RNA时，有两种常见的策略可以防止污染物。一个是设置一个单独的实验室进行设置和放大，大限度地减少移液步骤的数量，并防止扩增后管子打开。然而，由于实际原因，这并不总是可行的。此外，它无法保证避免污染。
防止污染的另一种常见的策略是在PCR扩增期间用dUTP部分或*替代dTTP，从而产生含有尿嘧啶的DNA。在开始PCR之前，用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UNG）处理PCR混合物。在初的变性步骤期间，温度升高至95℃，导致脱嘧啶位点的裂解和携带DNA的片段化。由于模板含有胸苷，因此不受UNG处理的影响。所有PCR都是用dUTP替代dTTP进行的先决条件。
使用我们的Cod UNG的好处是它在55˚C时不可逆转地灭活。Cod UNG是仅有兼容一步式RT-qPCR的UNG！
RT-qPCR中的PCR预防
Cod UNG是仅有兼容一步式RT-qPCR的UNG
在逆转录酶qPCR（RT-qPCR）中，RNA是初始模板。然而，污染物的问题在这里可能与常规PCR一样多。逆转录后，cDNA是PCR的模板。如果您的样品被先前PCR的PCR产物污染，则引物无法区分cDNA和DNA，从而导致错误结果。
在一步法RT-qPCR试剂盒中，将RNA加入含有逆转录酶和聚合酶的主混合物中，使cDNA合成和qPCR在同一试管中。 大肠杆菌 UNG / UDG的宜工作温度可达约。50˚C并且通常保持其活性达到约。70℃。该温度范围与一步法RT-qPCR方案中的残留预防不相容，因为 大肠杆菌 UNG / UDG将在逆转录期间去除掺入cDNA中的尿嘧啶，从而导致模板降解。
来自ArcticZymes的重组表达的Cod UNG初是从冷适应生物大西洋鳕鱼中分离的。Cod UNG在20˚C至40˚C的温度范围内具有高活性，在温度高于42˚C时会迅速失去活性，并且在55˚C时已经不可逆转地失活。由于Cod UNG的宜温度范围与大肠杆菌相比要低得多 UNG / UDG，Cod UNG兼容单管RT-qPCR。通过添加Cod UNG至终浓度0.01U /μl简单地进行残留预防，并在开始RT-qPCR之前在25℃引入5分钟的孵育步骤。或者，可以将浓度增加至0.04U /μl并省略预孵育步骤。Cod UNG将有效去除样品设置和循环仪升温过程中的残留污染。
在这里，我们显示Cod UNG可用于在含有dUTP而非dTTP的商业一步法RT-qPCR主混合物中进行残留物预防。用Cod UNG处理不影响靶cDNA，产生与未处理样品相同的Cq值。为了比较，用通用UNG处理导致显着的Cq延迟，证明与一步RT-qPCR不相容。
| Cod UNG与一步式RT-qPCR兼容 |
| 图1. Cod UNG与一步法RT-qPCR中的通用UNG相比较。进行一步RT-qPCR，将Cod UNG和通用UNG与未处理的对照进行比较。用Cod UNG处理不影响靶cDNA，产生与未处理样品相同的Cq值。用通用UNG处理导致显着的Cq延迟，证明与一步RT-qPCR不相容。 |
| Cod UNG有效去除残留的扩增子 |
| 图2. Cod UNG有效去除DNA。在进行一步RT-qPCR之前，将含有尿嘧啶的DNA的加标引入RNA样品中。没有引入预孵育步骤。用Cod UNG治疗成功地将加标的扩增子移除至检测限以下。 |
热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG。该热敏UDG酶能有效地水解单链或双链 DNA 上的尿嘧啶，产生的缺嘧啶位点，在高温或高 pH 下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。而来源于嗜冷海洋细菌的热敏UDG在50℃ 5min即*失活，在进行PCR扩增前，在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性），25℃10min即可消除PCR产物的残留污染，由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶（热敏性）在PCR循环的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。
应用 |
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活性定义 |
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| 在标准反应体系下，37°C每分钟催化 60 pmol 尿嘧啶从含尿嘧啶的双链 DNA 上释放所需要的酶量为一个活性单位。 | ||
反应buffer |
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| Heatlabile Uracil DNA Glycosylase (UDG)与绝大多数的PCR 聚合酶反应缓冲液都是兼容的，但在高离子浓度(>100mM)下活性会受到抑制。 | ||
酶保存液 |
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| 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 | ||
储存 |
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| -20℃可保存2年，避免反复冻融。 | ||
热失活 |
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| 50℃，10min。 |