产品组份
Buffer GTL: 12 ml (50T)
Buffer GL: 12 ml (50T)
Buffer GW1（concentrate）: 13 ml (50T)
Buffer GW2（concentrate）: 15 ml (50T)
Buffer GE: 7 ml (50T)
Proteinase K** : 1 ml (50T)
Spin Columns DM with Collection Tubes: 50个 (50T)
** Proteinase K（蛋白酶K）：-20℃保存，开盖后防止空气及枪头污染，如果出现絮状 物，是因为溶解缓冲液中的钙离子在磷酸盐中可能会产生不溶解性沉淀，离心取上清，不影响使用效果。

自备试剂
无水乙醇；Enzymatic Lysis Buffer（提取革兰氏阳性菌基因组DNA时须准备）。
Enzymatic Lysis Buffer 配方：20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2％Triton X-100；终浓度为20mg/ml的Lysozyme（溶菌酶）。

实验前准备及重要注意事项
1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取DNA片段较小且提取量下降。
2. 如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。
3. 第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4. 使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56˚C水浴重新溶解。
5. 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A（100mg/ml），RNase A 本试剂盒并未提供，可单独订购。

操作步骤
血液及细胞样本基因组提取
1. 材料处理
a) 如果提取材料为哺乳动物抗凝血液（无核红细胞），可直接向50-200μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入Buffer GTL补足至200μl。
b) 如果提取材料为禽类，鸟类，两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，取5-10μl新鲜或冷冻的抗凝血液样品，加入Buffer GTL补足至200μl。
c) 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液（最大提取量为5×106个细胞），2000 rpm（400xg）离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮。
注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/ml的RNase A 溶液，涡旋15秒，室温放置2分钟。
2. 加入20μl Proteinase K 溶液,混匀。
3. 加入200μl Buffer GL，涡旋振荡充分混匀，56˚C水浴10分钟。
4. 短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl无水乙醇，涡旋振荡充分混匀，短暂离心。
注意：
1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织在加入BufferGL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
5. 上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400 xg） 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。
8. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
9. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000 rpm 离心1分钟，收集DNA溶液，-20˚C保存DNA。
注意：
1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）Buffer GE在65-70˚C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20˚C保存。

动物组织基因组提取
1. 材料处理：如果提取材料为动物组织，取25 mg（脾组织用量应少于10 mg）；如果材料为鼠尾，取一段长度为0.4-0.6 cm的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm的小鼠鼠尾。
a. 样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5 ml离心管中，加入180 μl Buffer GTL，将不同样品做好标记。
b. 若使用匀浆器处理样本，匀浆前向样本中加入不超过80 μl Buffer GTL，匀浆后加入100 μl Buffer GTL。
注意：1）确保各组织的量不要超出推荐范围。2）组织样本在加入Buffer GTL之前用液氮研磨或加入Buffer GTL用匀浆器匀浆处理，可以增加裂解效率。
2. 加入20 μl Proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀。56˚C水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。
注意：1）不同组织消化时间不同，通常1-3小时即可完成，鼠尾需要消化6-8小时，必要时过夜消化，不会影响后续操作。2）如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，延长56˚C孵育时间或再加入20 μl Proteinase K消化。3）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl的浓度为100mg/ml的RNase A溶液，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。
3. 加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70˚C水浴10分钟。短暂离心后加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：1）加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织（如脾，肺）在加入Buffer GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。
4. 短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400xg ）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm。离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤6。
7. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。
8. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。2）Buffer GE在65-70°C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20°C保存。

细菌基因组提取
1. 细菌样本预处理
1a. 革兰氏阴性菌
（1）取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，12,000 rpm（~13,400xg）离心1分钟，尽量吸净上清。
（2）向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。
（3）加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，56°C孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。
注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
（4）加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。
1b. 革兰氏阳性菌
（1）取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备）中，12,000 rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
（2）加入180 μl Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。
（3）37°C孵育30分钟。
（4）加入20 μl Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。56℃孵育30分钟。
注意：1）如果需要，95°C孵育15分钟可以使病原体失活，但是95°C孵育会造成一些DNA的降解。2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
2. 加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。
注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。
3. 将步骤2所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（SpinColumns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤5。
6. 12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
7. 将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20°C保存DNA。
注意：
1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）Buffer GE在65-70°C水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
4）因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。