zeptometrix  0801008说明书 

HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0

预期用途
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0是一种用于检测人类免疫缺陷的酶联免疫分析方法。
细胞培养基中的病毒1型（HIV-1）p24抗原。它可用于监测
HIV-1或测定基于HIV-1的慢病毒样本的滴度。因为p24的氨基酸序列在
不同的HIV-1分离株，本试验检测了来自HIV-1亚型a-f的p24。对人类没有交叉反应。
免疫缺陷病毒2型（HIV-2）、猴免疫缺陷病毒（SIV）或人类T细胞白血病病毒I型和II型
（htlv i和ii）p24或任何gag基因产物。
retro-tek hiv-1 p24抗原Elisa 2.0仅供研究使用。不用于诊断程序。
试验原理
微孔板上覆盖着一种单克隆抗体，该抗体对HIV-1的p24 gag基因产物具有特异性。HIV-1 p24抗原
在样品培养期间，将样品特别捕获到固定抗体上。然后捕获的抗原
与人抗HIV-1抗体结合辣根过氧化物酶（HRP）反应。在随后添加
底物，颜色随着HRP酶的反应而发展。合成的光密度与HIV-1 p24的量成正比。
样本中存在抗原。然后绘制一组标准稀释液的吸光度值。p24的量是
通过点到点图的插值或标准曲线的线性回归分析确定。
试剂
供应材料：
•用于96次测定的HIV-1 p24抗体涂层微孔板，5个平板：12×8井条。涂有鼠药的水井
抗HIV-1 p24的单克隆抗体。
•HIV-1 p24检测抗体，5 x12 ml：含有HRP（辣根过氧化物酶）-与HIV-1结合的人抗体
从HIV-1人源材料中纯化。
•HIV-1 p24抗原标准，5 x 0.5 ml：含有来自山羊HIV-1 IIIB的被破坏的、热灭活的病毒抗原。
血清，Triton X-100®，叠氮化纳。
•溶解缓冲液，5 x 5 ml:Triton X-100®在PBS和2-氯乙酰胺中。
测定稀释剂，5×100毫升：含有山羊血清，PBS，Triton X-100®，和2-氯乙酰胺。
•10x洗板缓冲液，5 x 125 ml：含有PBS、Tween 20®和2-氯乙酰胺。
•基质，5 x 12 ml：含有四甲基联苯胺（TMB）。
•微孔板封闭剂（1 pk）：每包10个封闭剂
•停止溶液，5 x 12 ml：含有盐酸（HCl）。
•封板剂：5 x10
•可再密封塑料袋：5个
？Triton X-100是Union Carbide Chemicals and Plastics Co.，Inc.的注册商标。Tween 20是
帝国化学工业的商标。

存储
将所有试剂盒储存在2°-8°C的温度下。不要冷冻。当正确存放时，该套件在包装盒上注明的日期前是稳定的。
标签。
所需但未提供的材料：
•一次性手套
•经验证的可调节微量移液管，单通道和多通道
•用于制备样品和控制稀释的试管和试管架
•量筒和各种烧杯
•经验证的自动微孔板清洗机或手动真空抽吸设备
验证培养箱温度为37°C±1°C
•经验证的微孔板读卡器
计时器
•1%次氯酸钠作为消毒剂。可由家用漂白剂制成
•蒸馏水或去离子水
注意事项
仅供研究使用。不用于体外诊断。
•进行分析前，仔细阅读所有说明。
•使用通用预防措施处理套件组件和试样。
•为避免交叉污染，对每个样品使用单独的吸管头。
•当测试潜在感染性人体样本时，遵守所有适用的地方、州和联邦法规。
关于生物有害物质的处理。
•HIV-1 p24抗原标准含有叠氮钠作为防腐剂。叠氮化纳可能与铅或铜管发生反应。
形成爆炸性的金属叠氮化物。处理后用大量水冲洗管道，以防止叠氮化物在
排水沟。
•停止溶液含有盐酸，可能导致严重烧伤。如果接触到眼睛或皮肤，请冲洗
立即用水并寻求医疗救助。穿防护服和护目镜。
•用于制造HIV-1检测仪抗体的人源材料已经过测试，结果为阴性。
乙型肝炎表面抗原。用于制备HIV-1 p24抗原标准的病毒裂解液已被
化学破坏和加热。把这些试剂当作能传播传染源的试剂来处理。
•尽管p24抗原保存良好，但一些HIV-1分离株和重组克隆可能表现出轻微的反应性。
与HIV-1 p24抗原标准相比的差异包括该试剂盒。

试剂的制备
•使用前将所有试剂置于室温。
•洗板缓冲液：使用前，将10倍洗板缓冲液1:10在蒸馏水或去离子水中稀释。1X洗板缓冲器
可在2°-8°C下储存1周。10倍洗板缓冲液（目录：0801060）的附加瓶可
命令。
•洗板：将洗板机或其他点胶设备的点胶量设置为至少350微升或高达
可能不会溢出微孔板。这将确保*洗井并防止潜在的
由移液管或板密封件拆卸过程中可能发生的试剂飞溅引起的信号背景。
•试验准备：标记用于制备标准和样品的试管。在每条带子的末端贴上标签
标签，以确定试纸条在分析过程中是否与板架分离。如果整个96孔板
不要使用，从板架上取下多余的条带。将多余的条带和干燥剂放入可重新密封的塑料中
包装、密封并在2°-8°C下储存。
•HIV-1 p24抗原标准：根据HIV-1 p24抗原标准制备一系列六个标准。使用稀释液
表1中的方案。在完成检测后，任何稀释的HIV-1 p24抗原标准都应
丢弃的。

标准品不需要用溶解缓冲液处理。
•试样：将50微升溶解缓冲液移液至450微升样品中，在试管中处理样品，并充分混合。
或者，只要样品被1/10体积的溶解缓冲液破坏，就可以使用其他体积。未知的
样品建议制备一套10倍稀释液，以确保其中一种稀释液符合标准。
曲线。可以用分析稀释剂或细胞培养基稀释。处理过的样品可以长期保存在
-20℃或更低（如有必要） 

试验程序
步骤1：用350μl 1X洗板缓冲液和
抽吸。预洗去除了微孔板稳定剂，是实现均匀和宜反应性的必要条件。
用倒置的微孔板或吸水毛巾垫上的条状物*吸干。继续罢工直到不行
液滴留在井里。添加样品前，不要让洗过的盘子*干燥。干燥
会对测试结果产生不利影响。
第二步：用准备好的标准配置两条带，如下所示。在
化验。此井用于基板空白。用移液管将200微升的标准品1-6移到重复井和7（0 pg/ml）中。

第3步：用移液管将按照“试剂制备”一节所述制备的每个试样200微升移到重复孔中。
第4步：用平板密封器覆盖微孔板，并在37°C±1°C下培养至少1.5小时或过夜（多24小时）。
孵育时间短可能导致微板边缘效应。培养时间越长，敏感性越高。
步骤5：如步骤1所述，抽吸和清洗板6次。
步骤6：用移液管将100微升HIV-1 p24检测抗体移入每个孔中，底物空白除外。用一个
在37°C±1°C下培养1小时。
步骤7：如步骤1所述，抽吸和清洗板6次。
第8步：用移液管将100微升基质移入所有培养孔中，在室温（18°-25°C）下培养30分钟。一
在含有病毒抗原的井中会出现蓝色。
第九步：用100微升停止液移液管将反应停止。将导致颜色从蓝色变为黄色。
第10步：在15分钟内，用一个微板阅读器在450纳米处读取每个孔的光密度。

计算和解释结果
测试有效性：
•0.0 pg/ml标准的光密度不应超过0.120。如果两个或更多的井高于0.120，则测试
无效。
•125 pg/ml p24标准的光密度值应大于1.100，否则试验无效。
•测试样品的平均吸光度读数必须低于125 pg/ml，否则必须重新测试样品。
在更高的稀释度范围内。如果试样的平均吸光度读数低于
3.9 pg/ml，则p24浓度低于分析定量限值。

截止值的确定：
在0.0 pg/ml样品光学值的平均值上添加0.030的预定系数。这是对
检测化验结果。该值是确定截止值的一般准则。或者，更准确的结果可能
通过在一组已知的负样品的平均光密度中添加至少两个标准偏差来获得。
样本建立统计截止值。吸光度值大于或等于截止值但
低于3.9 pg/ml的平均吸光度值被认为是定性阳性。

要量化HIV-1 p24的水平：
计算每个p24标准品和试样的平均吸光度。使用线性图纸或计算机绘图
软件，在X轴上绘制HIV-1 p24抗原标准（pg/ml）的浓度与
Y轴上的每个标准。然后用插值法或线性法测定标本中HIV-1 p24抗原的浓度。
从标准曲线进行回归分析。确保对所有稀释进行校正，包括在
添加溶解缓冲液。供试品吸光度值必须在标准曲线内才能准确定量。
病毒滴度（tu/ml）的测定：
慢病毒的每个物理粒子（pp）大约有2000个p24分子：
（2×103）
）x（24 x 103 da，每pp p24），48 x 106
/阿伏加德罗=（48 x 106
）/（6 x 1023）=8 x 10-17g P24/聚丙烯，大约
每1 x 10-16g P24 1 pp，每p24 1 x 104 pp。
一个包装合理的VSV-G假型慢病毒载体的感染指数为每1000个单位1个单位。
物理粒子（pp）至1 tu/100 pp（或更小）。因此，p24的范围约为10至100 tu/pg。
精度数据

资料
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