immunoprecise MQ 17.101-96说明书

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immunoprecise MQ 17.101-96说明书

roduct Name

Antibody Based Assay for PAD activity (ABAP)

 基于抗体的PAD活性试验(ABAP)

CAT No.

MQ 17.101-96

 

Quantity

96 well test

 

免责声明

该试剂盒仅供研发使用。不得用于诊断或治疗程序。

在研究领域外使用需要ImmunoPrecise Antibodies的许可证。

 

产品描述

基于抗体的PAD活性试验(ABAP)是一种用于测定细胞和组织裂解物中PAD酶活性的固体酶联免疫吸附试验(ELISA)。此外，其可与重组PAD酶联合用于PAD抑制试验。将含精氨酸的肽包被在96孔板的条带上。在每个试剂条上，用含脱亚胺精氨酸的肽包被孔H，作为阳性对照。在与重组PAD酶或含有PAD酶的细胞/组织裂解物孵育期间，精氨酸是  被  去亚胺化的。  用含PAD的溶液孵育后，清洗过量的酶  离开  和  a  单克隆  向孔中加入去亚胺精氨酸特异性检测抗体。孵育后，洗涤孔并用HRP标记的多克隆抗小鼠免疫球蛋白抗体孵育。

使用HRP底物显色微孔板可产生与已脱亚胺精氨酸量成正比的染色反应。在酶标仪中测定的光密度可直接与试验中存在的对照酶的酶活性相关，从而定量PAD酶活性。

 

使用重组人PAD4验证ABAP  （图1）和多种PAD表达组织的小鼠组织裂解物（图2）。

 

试剂

  • ABAP 96孔板。每个试剂条的孔H用含脱亚胺精氨酸的肽包被，作为ABAP试验中的阳性对照。所有其他孔均用含精氨酸的肽包被。

· 用于活性校准的人PAD酶（从细菌细胞裂解物中纯化人PAD酶）。

· 含有叠氮化纳作为防腐剂的脱亚胺缓冲液。

  • 小鼠抗脱亚胺精氨酸。特异性结合脱亚胺精氨酸的专有ModiQuest Research小鼠单克隆抗体。

· HRP标记的抗小鼠Ig抗体。

 

需要但未提供的试剂和设备

  • 如果使用四甲基联苯胺(TMB)作为底物，则多孔酶标仪能够在450 nm处读数。如果使用不同的底物，应相应调整波长。

· 经校准的可调节精密移液器，用于5倍体积

μl和1000μl。

· 洗板机（选配）或歧管分配器。

· 加湿室。

· 各种尺寸的经校准烧杯和量筒。

· 涡旋混合器。

· 清洗缓冲液（PBS + 0.05%吐温20）。

· 牛血清白蛋白(BSA)。

· 稳定显色剂(TMB)。

· 2M H2SO4（终止液）。

 

注意事项

1. 专业用户。

2. 与任何生物来源的产品一样，应使用适当的处理程序。

  • 该产品可与不同的样本类型和材料配合使用，因此各个实验室应对所采用的检测系统进行验证。

 

储存/稳定性

· 人PAD酶

Store at -80 ℃下储存。使用后，立即在-80 ℃下重新冷冻。

避免反复冻融循环。将酶一直置于冰上。

· ABAP 96孔板

Store at -20 ℃下储存。

避免反复冻融循环。

· 小鼠抗脱亚胺精氨酸

在-20 ℃下储存。*使用后，在4 ℃下储存。避免反复冻融循环。

· HRP标记的抗小鼠Ig

在-20 ℃下储存。*使用后，在4 ℃下储存。避免反复冻融循环。

· 脱亚胺缓冲液

Store at -20 ℃下储存。

 的制备

打开前，在4 ℃下旋转含有MQR人PAD酶的小瓶。对于活性校准，PAD酶应在脱亚胺缓冲液(40 mM Tris-HCl pH 7.5；5 mM CaCl2；1 mM DTT)中以适当浓度（例如，从2.0至0.002 mU）稀释，用于活性曲线。

每孔100µl脱亚胺缓冲液中2.0 mU PAD可产生大脱亚胺，而 < 0.002 mU PAD/孔无可检测活性。

程序

  • 用100µl脱亚胺缓冲液在37 ℃下预孵育96孔板30 min。该步骤是平衡ABAP板所必需的。
  • 倒置倒空ABAP板，置于冰上。此外，将脱亚胺缓冲液置于冰上。
  • 在冰冷的脱亚胺缓冲液中稀释需要检测PAD活性的组织裂解物。使用PAD活性校准样本进行相同操作。每孔应加的总体积为100 μL（建议检测不同浓度的裂解液。通常100 μL脱亚胺缓冲液中1 μL组织裂解液就足够了）
  • 将所有样品加入ABAP板中，同时将所有样品置于冰上。
  • 在37 ℃的加湿室中孵育ABAP板1小时15 min。

6. 用清洗缓冲液清洗微孔板5次。

  • 用清洗缓冲液 + 1%BSA以1:1000稀释MQR小鼠抗脱亚胺精氨酸抗体。每孔加入100 μL抗体溶液。
  • 在37 ℃的加湿室中孵育ABAP板1小时。

9. 用清洗缓冲液清洗微孔板5次。

  • 用洗涤缓冲液 + 1%BSA以1:2000稀释HRP标记的抗小鼠Ig抗体。每孔加入100 μL抗体溶液。
  • 在37 ℃的加湿室中孵育ABAP板1小时。

12. 用清洗缓冲液清洗微孔板5次。

13. 用不含吐温-20的清洗缓冲液清洗微孔板3次。

  • 向各孔中加入50µl TMB底物，并使其呈蓝色（室温下避光）。

请注意：可实现快速开发。

  • 向各孔中加入50µl 2M H2SO4以终止反应。蓝色将变为黄色。

16. 在多孔酶标仪中读取450 nm处的OD。

 

图1：向包被含精氨酸肽的ABAP板中加入越来越多的重组人PAD酶，导致检测到越来越多的含瓜氨酸肽。加入EDTA通过捕获钙离子消除PAD活性。

 

 

 

图2：不同小鼠组织样本中PAD活性的检测。在含钙(-EDTA)或去钙(+ EDTA)对照反应中使用1μl组织裂解物，并通过标准ABAP程序监测PAD活性。将组织裂解物PAD活性归一化为大重组人PAD活性(-EDTA)，并抑制人PAD(+ EDTA)。请注意：这是一张显示ABAP测定能力的代表性图片。