无DMSO干细胞冻存液

StemCell Keep

StemCell Keep 是一种高效的玻璃化细胞冻存液，用于灵长类胚胎干细胞（ES）和诱导型多能干细胞（iPS）的保存。

◆特点•优势

    ●    无动物源蛋白、无DMSO；

    ●    通过玻璃化保护ES和iPS细胞；

    ●    可维持干细胞分化能力；

    ●    采用新型冷冻保护剂，可利用玻璃化冷冻技术进行ES和iPS细胞克隆的高效保

           存；

    ●    足够分装100管；

    ●    无细菌、真菌和支原体污染；

    ●    保质期长，4℃下可保存2年

　    * 仅用于科学研究，不能用于临床诊断。

◆案例•应用

冷冻玻璃化

灵长类ES和iPS细胞对冷冻损害非常敏感

●   灵长类ES和iPS细胞用含10% DMSO的冻存液-80℃保存后活性很低

●   灵长类ES和iPS细胞克隆在上述条件下活力很低

                      ↓

通过玻璃化低温保存ES和iPS细胞

●   玻璃化是使液体形成玻璃状物质

●   使用玻璃化溶液悬浮细胞，然后转移到液氮罐防止水分缺失

●   细胞在冷冻过程中被保护

                      ↓

玻璃化技术保存ES和iPS细胞存在的问题

●  由于玻璃化的形成需要高浓度的溶液，高渗透压对细胞有毒性

●  操作时需要快速溶解细胞，以防重结晶

●  操作需要经验丰富的操作人员

                      ↓

常规玻璃化溶液存在的问题

●  大体积(200 μL) 的玻璃化溶液可造成玻璃化条件的不稳定性

●  传统的玻璃化溶液含有DMSO和乙酰胺，DMSO对OCT-4的表达有影响，而乙酰胺被认为是一种致癌物

                      ↓

StemCell Keep是一种新颖的玻璃化溶液，

可改善传统玻璃化溶液存在的问题。

　对比数据

上述实验数据反映了人iPS细胞冻存之后的克隆形成率和复苏率。接种后第一天，以未冷冻保存细胞100%的克隆形成率为对照，DAP213（常用作玻璃化试剂）冻存细胞只有15%的克隆形成率，而StemCell冻存细胞的克隆形成率为80%。接种后第四天，细胞生长为大克隆之后统计细胞的复苏率，StemCell冻存iPS 细胞的复苏率达到62%，明显优于DAP213冻存细胞28%的复苏率。

实验操作步骤　

※ 在具体实验展开之前请先进行预实验。

冻存步骤

1. 在超净台上放置一个装满液氮的保温瓶；

2. 用含0.25%的胰蛋白酶和1mg/mL IV型胶原酶的PBS溶液解离ES/iPS细胞；

* 一个60mm培养皿，细胞达到汇合状态时，约可分装1-5管；

3. 离心，去上清( 需在冰上操作)；

4. 用200μL的StemCell悬浮细胞。将冻存管转移到液氮中放置1分钟；

* 如果玻璃化成功，溶液应呈透明状。

5. 将冻存管转移至液氮罐保存。

 

复苏步骤

1. 准备含有9mL细胞培养液的离心管，37℃水浴；

   * 一次复苏一管。

2. 将冻存管从液氮罐转移至含有液氮的保温瓶中，在超净台上操作；

3. 迅速添加1mL预热的细胞培养基，用枪头轻轻混匀 ；

4. 将所有的稀释后细胞转移至离心管，离心洗脱细胞；

5. 将细胞转移至培养皿，根据实验操作步骤进行细胞培养。

 

实验结果

人iPS细胞StemCell冻存复苏之后的分化能力

　　细胞的未分化标记物ALP(A)、OCT-4 (B)、SSEA-4 (C) 和TRA-1-60(D) 染色都为阳性，保持着未分化状态。

人iPS细胞StemCell冻存复苏之后的分化能力 　人iPS细胞形成拟胚体之后，在普通培养基上培养1周，依然可以检测到未分化标记。