CUBIC 组织透明化试剂

具有单细胞分辨率的全脑/全身成像

＊数据由Etsuo A Susaki博士和 Hiroki R. Ueda, RIKEN博士提供

Hiroki R. Ueda博士等人开发了一种简单、高效、可扩展的脑/体透明化方法和成像/计算分析方法，CUBIC（clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis）。 　　CUBIC是一种基于亲水溶液（ScaleCUBIC Solutions）的、具有荧光保护、高性能及无需特殊设备等特点的组织透明化方法。 　　它可以利用LSFM技术实现可重复的整个器官和全身的透明化以及快速3D成像。CUBIC还提供3D图像的处理和分析，以提取生物信息。 　　所以，CUBIC提供了具有单细胞分辨率和图像信息学的全器官/全身成像平台，使广大用户能够针对细胞和器官层进行多个样品的实验。

◆CUBIC的优点

●　易于使用

●　无需特殊设备

●　支持后续的2D H＆E染色

●　高透明度

●　适用于多种器官

●　兼容IF（免疫荧光），FP（荧光蛋白）和其他荧光标记

◆CUBIC的应用

**一般情况下，可使用比例为7:3的固定溶液1和2（RI~1.49）混合溶液。

图1．使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠整体器官的透射图像

图2．使用Scale CUBIC Solution透明化前后小鼠2mm切片的透射图像

◆ CUBIC应用于荧光蛋白表达

图3．CAG-EGFP Tg小鼠（8w雄性）的全脑，全心脏和解剖肝脏的LSFM成像

◆CUBIC应用于病理学方法中

　　数据来源于S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017)/已被收录

图4．使用CUBIC透明化各种人体器官

使用CUBIC的石蜡样品的组织透明化和3D成像

图5．使用CUBIC的病理标本的组织透明化和3D成像

◆CUBIC 鱼类透明化案例

数据提供：东京海洋大学 海洋生物资源学院 二见邦彦老师

图6．使用CUBIC的鱼类透明化案例

实验步骤参见参考文献5）

图7．使用CUBIC处理后的鱼类内脏切片案例

-CUBIC处理后，切片5 μm，可用Mayer’s Hematoxylin染色-

图8．用抗体观察CUBIC处理后斑马鱼鳃的内脏片

◆CUBIC 甲壳类（螃蟹·鼠妇）透明化案例

数据提供：浜松医科大学 医学分光应用寄附研究生 绀野在老师，冈崎茂俊老师

图9．使用CUBIC的甲壳类透明化案例（上：螃蟹，下：鼠妇）

实验步骤参见参考文献6）

图10．观察CUBIC处理后（PI染色）甲壳类的全身（左：螃蟹，右：鼠妇）

实验步骤参见参考文献6）

注意：

　　列出的产品仅供实验室研究使用，不得用于药物、食品或人体。

组织透明化配套耗材：成像用透明室

相关资料

透明化试剂方法选择流程.pdf

CUBIC trial manual.pdf

组织透明化试剂Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：组织透明化的原则

Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：

Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配

 

Q：组织透明化的优势

Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化

Ａ：组织中特定的蛋白。组织透明化成为了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。

 

Q：透明化技术的比较

Ａ：下面是水性的透明化技术。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化DiI(细胞膜

Ａ：红色荧光探针，一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB有着一定优

Ａ：势。另外SeeDB会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。

Ａ：SeeDB2是为使用高NA物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY或者CUBIC

Ａ：会是更好的选择。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您应该根据您的物镜的WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过3mm。对于十分薄

Ａ：且脆弱的样品，我们建议使用琼脂糖包埋。

Ａ：使用CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重复性。

 

Q：试剂盒成分

Ａ：具体如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2mm的切片样品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S试剂盒（290-80801）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40mL

 

Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50mL

 

Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50mL

 

Q：样品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的

Ａ：荧光信号。

Ａ：CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。

Ａ：SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观

Ａ：察SeeDB透明化的样品中的荧光信号。

 

Q：抗体的荧光标记

Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。

 

Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：适用于CUBIC的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：适用于SeeDB2的显微镜

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）

 

Q：重构

Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表

Ａ：现。重构时也可以使用开源软件。例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。

 

Q：物镜推荐

 

Q：其他物种？其他器官？

Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。

Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

参考文献

[1]　E. A. Susaki.et al. : Cell ,157(3),726(2014).

[2]　K. Tainaka.et al. : Cell ,159(4),911(2014).

[3]　E. A. Susaki.et al. : Nature Protocols ,10,1709(2015).

[4]　S. Nojima.et al. : Scientific Reports ,7,9269 (2017).

[5]　S. Ohnuma. et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
[6]　A. Konno and S. Okazaki.: Zoological Letters, 4:13(2018).