粘蛋白检测试剂盒 Mucin Assay Kit


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CSR-FFA-Mu-K01E Mucin Assay Kit
粘蛋白检测试剂盒
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粘蛋白检测试剂盒粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

Mucin Assay Kit

——健康和美容研究试剂

 

背景


  粘蛋白属于高度糖基化蛋白质家族,是粘膜的主要成分,例如唾液,泪液,胃液,肠液。粘蛋白的 基本构型是枝状糖链连接到多肽的大分子。糖链的非均质特性使其具有多样性,分子具有各种功粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit能,如特异性分子识别。
  一些糖链识别病毒和细菌的特定蛋白质。粘蛋白锚定在肠中粘膜屏障功能中,阻止病原体和毒素通过肠壁进入血管中。该试剂盒可用于检测粪便中的粘蛋白含量。
  粘蛋白属于高分子(1000kda-10000kda)高度糖基化蛋白的家族。蛋白质核内的粘蛋白结构域富含苏氨酸、丝氨酸和羟脯氨酸,糖链的还原末端(GalNAc)通过翻译后O-糖基化与这些氨基酸频繁连接。该试剂盒具有确定粪便粘蛋白含量组分的功能。
  粪便粘蛋白测定可用作肠屏障功能的指标。该试剂盒利用荧光检测来测定粘蛋白的含量。

  我们提供的该试剂盒可以供研究功能性食物和感染的客户使用。

  步骤1:从粪便中提取和部分纯化粘蛋白。
  步骤2:粘蛋白O-糖苷连接的寡糖链的测定通过稀碱进行β-消除,形成糖链的还原端。还原碳水化合物在高温下进行荧光标记以产生荧光缩合物。


粘蛋白的结构

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

 试剂盒组分


组件

规格

数量

储存条件

缓冲溶液A

100mL

3

4-10℃

缓冲溶液B

25mL

1

缓冲溶液C

25mL

1

试剂A

1.0mL

1

试剂B

1.5mL

2

标准溶液(GalNA,250ug/mL)

1.0mL

1

酶溶液

1.5mL

1

◆优点特色


●  粘蛋白和IgA能阻止细菌和毒素的入侵

●  作为肠屏障的一部分,粘蛋白和IgA能防止病原菌和毒素通过肠壁转移到血管内。


测定理论
  通过对粪便中的β-葡萄糖苷酶热变性防止粪便粘蛋白降解
  ↓
  粗提取粘蛋白
  ↓
  用酶溶液分解淀粉
  ↓
  用乙醇沉淀纯化粘蛋白
  ↓
  将试剂A加入纯化的粘蛋白中,并在碱性条件下进行热处理。 (试剂A将与粘蛋白的糖还原末端反应,并在碱处理后发出荧光)
  ↓
  加入缓冲液C并测定荧光强度(激发336nm,荧光383nm)

  (具体操作请看相关资料)

◆案例应用


喂食高脂肪食物的大鼠肠屏障部分注射多酚的效果

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

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图1 粘蛋白定量标准曲线

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

图2 粪便中的粘蛋白含量

应用

  用于测定粪便中的粘蛋白含量。

 

相关资料

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

Mucin_Assay_Kit.

◆操作步骤


● 本产品是专为荧光酶标仪测量设计(96孔板)。
● 当使用荧光读板机时,可测量100个样品。
● 当使用分光光度计测量时,请使用微细胞。


缓冲液A的制备
用100mL蒸馏水溶解1块片剂。
粪便粉末的制备:粪便冻干并在研钵中研磨,储存在-20℃备用。

II.粪便粘蛋白的测定
  1称量100mg粪便粉末放入微量试管(2mL)中,加入1mL缓冲液A,然后用涡流混合器混合30秒钟。

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

  2在95℃下加热试管10分钟使细菌的糖苷酶变性。


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  3在37℃下加热90分钟,从粪便中提取粘蛋白。

  4在4℃下离心20,000×g 15分钟。
  5将200μL上清液转移到另一个微量试管中,加入200μL缓冲液B,用涡流混合器混合溶液。

  6加入10μL酶溶液混合,在50℃下加热试管20分钟分解淀粉。
  7将离心管冷却至室温,加入125μL的99.5%乙醇,混合后,在-20℃下静置过夜。

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

  8次日,在4℃下20,000×g离心10分钟,去上清。向沉淀加入1mL缓冲液A,重溶沉淀。(样品溶液)

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  9、将20uL样品溶液和标准溶液转移到另一个微量试管(500uL)中,加入24uL试剂混合物(使用前以1:5混合试剂A和试剂B),混合后, 100℃下加热微量试管30分钟。

  10、冷却至室温,加入200uL缓冲液C,用涡流混合器混合。

粘蛋白检测试剂盒                  Mucin Assay Kit

  11将100μL溶液转移到96孔黑色孔板中,并在波长(例如:336nm em:383nm)实用荧光读板机测量荧光强度。
  12通过如下所示的连续稀释创建标准曲线。 通过这些点绘制平滑曲线以构建标准曲线。 通过标准曲线读取样品的浓度。
  13计算1g粪便中的粘蛋白含量。步骤(12)测得的值的50倍是1g粪中的粘蛋白含量。

Calibrator Number

Quantaity of Standard

Quantaity of Dilution Buffer 

Final Concentration

1

500μl of Standard Solution

0

250μg/mL

2

500μl of Calibrator 1

500μl

125μg/mL

3

500μl of Calibrator 2

500μl

63μg/mL

4

500μl of Calibrator 3

500μl

31.5μg/mL

5

500μl of Calibrator 4

500μl

15.75μg/mL

6

500μl of Calibrator 5

500μl

7.875μg/mL

7

0

500μl

0

工作校准品:N-乙酰葡萄糖胺250μg/ mL
● 通过连续稀释创建标准曲线,如下图所示。
● 剩余的未稀释校准品应储存在2-10°C。
● 稀释校准品稳定,可在2-10°C保存1个月。

参考文献

[1]Susumu Honda,Yoshikazu Matsuda, Masaye Takahashi, and Kazuaki KakehiFluorimetric Determination of Reducing Carbohydrates with2-Cyanoacetamide and Application to Automated Analysis of Carbohydrates as Borate Complexes.(1980) Analytical Chemistry, Vol.52, No. 7

[2Bovee-OudenhovenIM, Termont DS, Heidt PJ, et al.: Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut 40: 497-504, 1997.

[3Crowther RS, Wetmore RF: Fluorometric assay of O-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem 163: 170-174, 1987.

[4Okazaki Y, Han Y, Kayahara M, Watanabe T, Arishige H, Kato N. Consumption of curcumin elevates fecal immunoglobulin A, an index of intestinal immune function, in rats fed a high-fat diet. J NutrSciVitaminol (2010);56(1):68-71.

[5YukakoOkazaki,HiroyukiTomotake, Kazuhisa Tsujimoto, Masahiro Sasaki,andNorihisa Kato. Consumption of a Resistant Protein, Sericin, Elevates Fecal Immunoglobulin A, Mucins, and Cecal Organic Acids in Rats Fed a High-Fat Diet. (2011) The Journal of Nutrition, 21, 10.3945/jn.111.144246.

[6ZakiUtama,Yukako Okazaki, Hiroyuki Tomotake, Norihisa Kato, Tempe Consumption Modulates Fecal Secondary Bile Acids, Mucins, Immunoglobulin A, Enzyme Activities, and CecalMicroflora and Organic Acids in Rats. Foods Hum Nutr(2013) 68:177-183