产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 产品价格 |
CSR-FFA-Mu-K01E | Mucin Assay Kit 粘蛋白检测试剂盒 |
1盒 |
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
粘蛋白检测试剂盒
Mucin Assay Kit
——健康和美容研究试剂
◆背景
粘蛋白属于高度糖基化蛋白质家族,是粘膜的主要成分,例如唾液,泪液,胃液,肠液。粘蛋白的 基本构型是枝状糖链连接到多肽的大分子。糖链的非均质特性使其具有多样性,分子具有各种功能,如特异性分子识别。
一些糖链识别病毒和细菌的特定蛋白质。粘蛋白锚定在肠中粘膜屏障功能中,阻止病原体和毒素通过肠壁进入血管中。该试剂盒可用于检测粪便中的粘蛋白含量。
粘蛋白属于高分子(1000kda-10000kda)高度糖基化蛋白的家族。蛋白质核内的粘蛋白结构域富含苏氨酸、丝氨酸和羟脯氨酸,糖链的还原末端(GalNAc)通过翻译后O-糖基化与这些氨基酸频繁连接。该试剂盒具有确定粪便粘蛋白含量组分的功能。
粪便粘蛋白测定可用作肠屏障功能的指标。该试剂盒利用荧光检测来测定粘蛋白的含量。
我们提供的该试剂盒可以供研究功能性食物和感染的客户使用。
步骤1:从粪便中提取和部分纯化粘蛋白。
步骤2:粘蛋白O-糖苷连接的寡糖链的测定通过稀碱进行β-消除,形成糖链的还原端。还原碳水化合物在高温下进行荧光标记以产生荧光缩合物。
粘蛋白的结构 |
◆试剂盒组分
组件 |
规格 |
数量 |
储存条件 |
缓冲溶液A |
100mL |
3 |
4-10℃ |
缓冲溶液B |
25mL |
1 |
|
缓冲溶液C |
25mL |
1 |
|
试剂A |
1.0mL |
1 |
|
试剂B |
1.5mL |
2 |
|
标准溶液(GalNA,250ug/mL) |
1.0mL |
1 |
|
酶溶液 |
1.5mL |
1 |
◆优点・特色
● 粘蛋白和IgA能阻止细菌和毒素的入侵
● 作为肠屏障的一部分,粘蛋白和IgA能防止病原菌和毒素通过肠壁转移到血管内。
测定理论
通过对粪便中的β-葡萄糖苷酶热变性防止粪便粘蛋白降解
↓
粗提取粘蛋白
↓
用酶溶液分解淀粉
↓
用乙醇沉淀纯化粘蛋白
↓
将试剂A加入纯化的粘蛋白中,并在碱性条件下进行热处理。 (试剂A将与粘蛋白的糖还原末端反应,并在碱处理后发出荧光)
↓
加入缓冲液C并测定荧光强度(激发336nm,荧光383nm)
(具体操作请看相关资料)
◆案例・应用
喂食高脂肪食物的大鼠肠屏障部分注射多酚的效果
图1 粘蛋白定量标准曲线 |
图2 粪便中的粘蛋白含量 |
应用
用于测定粪便中的粘蛋白含量。
相关资料
Mucin_Assay_Kit.
◆操作步骤
● 本产品是专为荧光酶标仪测量设计(96孔板)。
● 当使用荧光读板机时,可测量100个样品。
● 当使用分光光度计测量时,请使用微细胞。
缓冲液A的制备
用100mL蒸馏水溶解1块片剂。
粪便粉末的制备:粪便冻干并在研钵中研磨,储存在-20℃备用。
II.粪便粘蛋白的测定
1、称量100mg粪便粉末放入微量试管(2mL)中,加入1mL缓冲液A,然后用涡流混合器混合30秒钟。
2、在95℃下加热试管10分钟使细菌的糖苷酶变性。
3、在37℃下加热90分钟,从粪便中提取粘蛋白。
4、在4℃下离心20,000×g 15分钟。
5、将200μL上清液转移到另一个微量试管中,加入200μL缓冲液B,用涡流混合器混合溶液。
6、加入10μL酶溶液混合,在50℃下加热试管20分钟分解淀粉。
7、将离心管冷却至室温,加入125μL的99.5%乙醇,混合后,在-20℃下静置过夜。
8、次日,在4℃下20,000×g离心10分钟,去上清。向沉淀加入1mL缓冲液A,重溶沉淀。(样品溶液)
9、将20uL样品溶液和标准溶液转移到另一个微量试管(500uL)中,加入24uL试剂混合物(使用前以1:5混合试剂A和试剂B),混合后, 100℃下加热微量试管30分钟。
10、冷却至室温,加入200uL缓冲液C,用涡流混合器混合。
11、将100μL溶液转移到96孔黑色孔板中,并在波长(例如:336nm em:383nm)实用荧光读板机测量荧光强度。
12、通过如下所示的连续稀释创建标准曲线。 通过这些点绘制平滑曲线以构建标准曲线。 通过标准曲线读取样品的浓度。
13、计算1g粪便中的粘蛋白含量。步骤(12)测得的值的50倍是1g粪中的粘蛋白含量。
Calibrator Number |
Quantaity of Standard |
Quantaity of Dilution Buffer |
Final Concentration |
1 |
500μl of Standard Solution |
0 |
250μg/mL |
2 |
500μl of Calibrator 1 |
500μl |
125μg/mL |
3 |
500μl of Calibrator 2 |
500μl |
63μg/mL |
4 |
500μl of Calibrator 3 |
500μl |
31.5μg/mL |
5 |
500μl of Calibrator 4 |
500μl |
15.75μg/mL |
6 |
500μl of Calibrator 5 |
500μl |
7.875μg/mL |
7 |
0 |
500μl |
0 |
工作校准品:N-乙酰葡萄糖胺250μg/ mL
● 通过连续稀释创建标准曲线,如下图所示。
● 剩余的未稀释校准品应储存在2-10°C。
● 稀释校准品稳定,可在2-10°C保存1个月。
参考文献
[1]Susumu Honda,Yoshikazu Matsuda, Masaye Takahashi, and Kazuaki KakehiFluorimetric Determination of Reducing Carbohydrates with2-Cyanoacetamide and Application to Automated Analysis of Carbohydrates as Borate Complexes.(1980) Analytical Chemistry, Vol.52, No. 7
[2]Bovee-OudenhovenIM, Termont DS, Heidt PJ, et al.: Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut 40: 497-504, 1997.
[3]Crowther RS, Wetmore RF: Fluorometric assay of O-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem 163: 170-174, 1987.
[4]Okazaki Y, Han Y, Kayahara M, Watanabe T, Arishige H, Kato N. Consumption of curcumin elevates fecal immunoglobulin A, an index of intestinal immune function, in rats fed a high-fat diet. J NutrSciVitaminol (2010);56(1):68-71.
[5]YukakoOkazaki,HiroyukiTomotake, Kazuhisa Tsujimoto, Masahiro Sasaki,andNorihisa Kato. Consumption of a Resistant Protein, Sericin, Elevates Fecal Immunoglobulin A, Mucins, and Cecal Organic Acids in Rats Fed a High-Fat Diet. (2011) The Journal of Nutrition, 21, 10.3945/jn.111.144246.
[6]ZakiUtama,Yukako Okazaki, Hiroyuki Tomotake, Norihisa Kato, Tempe Consumption Modulates Fecal Secondary Bile Acids, Mucins, Immunoglobulin A, Enzyme Activities, and CecalMicroflora and Organic Acids in Rats. Foods Hum Nutr(2013) 68:177-183