TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0酶试剂盒Takara

TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0
品牌	Code No.	产品名称	包装量	价格（元）	说明书	数量
Takara	RR019A	TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0	100 Rxns	￥1,683
Takara	RR019B (A × 2)	TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0	100 Rxns × 2	￥3,024

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■ 制品内容 (Code No.: RR019A : 100 次量^*1)

AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/μl) (Avian Myeloblastosis Virus来源)

50 μl

RNase Inhibitor (40 U/μl)

25 μl

Random 9 mers^*2 (50 pmol/μl)

50 μl

Oligo dT-Adaptor Primer (2.5 pmol/μl)

50 μl

RNase Free dH2O

1 ml

TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl)

25 μl

M13 Primer M4^*2 (20 pmol/μl)

50 μl

10 × RT Buffer [100 mM Tris-HCl (pH8.3)，500 mM KCl]

1 ml

5 × PCR Buffer

1 ml

dNTP Mixture (各10 mM)

150 μl

MgCl2 (25 mM)

1 ml

Control R-1 Primer^*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA下游引物)

25 μl

Control F-1 Primer^*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA上游引物)

25 μl

Positive Control RNA^*3 (2 × 10⁵ copies/μl)
(Transcribed poly(A)⁺ RNA of pSPTet3 plasmid)

25 μl

*1：1次反应即10 μl RT及 50 μl PCR

*2：引物序列

引物名称	各引物序列
Random 9 mers	5′-(P)NNNNNNNNN-3′
Oligo dT-Adaptor Primer	包含dT区域及M13 Primer M4序列。
Control F-1 Primer	5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′
Control R-1 Primer	5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′
M13 Primer M4	5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′

*3：Positive Control RNA

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA (约1.4 kb) 是带有30个A碱基的具有Poly(A)⁺ 尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。

图1. Positive Control RNA：使用各种引物所能扩增的DNA片段

■ 制品说明

PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂，可实现简单高效的RNA分析。
本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的特殊设计，大大地提高了Poly(A)⁺ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，避免扩增前由于错配或引物二聚体产生的非特异性扩增。

■ 保存

-20℃。

■ RNA LA PCR的原理

本试剂盒使用AMV由来的反转录酶由RNA合成cDNA，并可在同一反应管中使用TaKaRa Ex Taq HS扩增此cDNA。Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物等均可作为反转录引物用于cDNA合成。Oligo dT-Adaptor Primer同时适用于3′-RACE实验。

图2. RNA PCR的原理

■ 特点

RNA模板	适用于所有RNA
扩增片段大小	≤5 kb
反转录酶	AMV Reverse Transcriptase XL
DNA Polymerase	TaKaRa Ex Taq HS
RNase Inhibitor	必须使用 (Kit中含有)
合成第一条cDNA链的引物	Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游PCR Primer 可供选择
3′-RACE法	RT反应时使用Oligo dT-Adaptor Primer，PCR反应时下游引物使用M13 Primer M4
操作	在同一反应管中进行 (反转录酶在进行PCR反应前须进行高温失活)

■ 反转录反应时Primer的选择

Random 9 mers	适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。用Random 9 mers合成的cDNA进行PCR反应时，必须使用特异性引物。
Oligo dT-Adaptor Primer	适用于具有Poly(A)⁺ Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物 Primer 的rRNA及tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不具有Poly (A)⁺ Tail)。本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，可用M13 Primer M4进行3′-RACE实验。
特异性下游PCR Primer (PCR时的下游引物)	因其必须与模板序列互补，所以只适用于Target序列已知的情况。

■ 注意事项

1. 当同时需要进行数次反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix；其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、TaKaRa LA Taq 酶等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
4. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip)，以防止样品间污染。
5. 最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control反应，以确定最佳的PCR条件。

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