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| ■ 制品内容 (100 次量*1) |
| AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/μl) (来源于Avian Myeloblastosis Virus) |
50 μl |
| RNase Inhibitor*2 (40 U/μl) |
25 μl |
| Random 9 mers*2 (50 pmol/μl) |
50 μl |
| Oligo dT-Adaptor Primer (2.5 pmol/μl) |
50 μl |
| RNase Free dH2O |
1 ml |
| TaKaRa LA Taq (5 U/μl) |
25 μl |
| M13 Primer M4*2 (20 pmol/μl) |
50 μl |
| 10X RNA PCR Buffer |
120 μl |
| 100 mM Tris-HCl (pH8.3) |
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| 500 mM KCl |
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| 10X LA PCR Buffer II (Mg2+ Free) |
500 μl |
| dNTP Mixture (各10 mM) |
150 μl |
| MgCl2 (25 mM) |
1 ml |
| Control F-1 Primer*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA下游引物) |
25 μl |
| Control R-1 Primer*2 (20 pmol/μl) (Positive Control RNA上游引物) |
25 μl |
Positive Control RNA*2 (2 × 105 copies/μl)
(Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid) |
25 μl |
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*1：本试剂盒可用于100次反应 (总反应量：RT 反应10 μl, PCR反应 50 μl)
*2：【各种引物序列】 |
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| 引物名称 |
各引物序列 |
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Random 9 mers
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5′-NNNNNNNNN-3′ |
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Oligo dT-Adaptor Primer
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包含dT区域及M13 Primer M4序列。 |
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Control F-1 Primer
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5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ |
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Control R-1 Primer
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5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ |
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M13 Primer M4
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5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ |
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| *3：【Positive Control RNA】 |
| 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA (约1.4 kb) 是带有30个A碱基的具有Poly(A)+ 尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。Control RNA简图见图1。 |
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| 图1. Positive Control RNA：使用各种引物所能扩增的DNA片段 |
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| ■ 制品说明 |
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TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1使用TaKaRa LA Taq酶，实现反转录后的更长更准确的PCR反应。TaKaRa LA Taq酶是Takara Bio公司研制的LA (long and accurate) PCR*反应的关键组成。
本试剂盒利用LA Technology的优势特点，用AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 来源的反转录酶，由RNA反转录至cDNA，然后再在同一反应管中用TaKaRa LA Taq扩增此cDNA，操作简单，使用方便。本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的特别设计，使从Poly (A)+ RNA 3’端合成cDNA的效率更高，从而可以利用3’-RACE法高效扩增RNA的3′端未知区域。
*：U.S.Patent 5,436,149 for LA Technology is owned by TAKARA BIO INC. |
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ 特点 |
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RNA模板
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适用于所有RNA |
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扩增片段大小
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～12 kb |
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反转录酶
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AMV Reverse Transcriptase (反转录反应温度在42℃～60℃) |
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DNA Polymerase
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TaKaRa LA Taq |
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RNase Inhibitor
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试剂盒中含有 |
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合成cDNA第一条链的引物
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Random 9 mers或Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游PCR Primer 可供选择 |
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3′-RACE法
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RT反应时使用Oligo dT-Adaptor Primer
PCR反应时下游引物使用M13 Primer M4 |
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操 作
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在同一反应管中进行 (反转录酶在进行PCR反应前须进行高温失活) |
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| ■ 使用注意 |
1. 当同时需要进行多个反转录反应或PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液 (其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture、MgCl2等），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 使用Reverse Transcriptase (AMV)、RNase Inhibitor、TaKaRa LA Taq 等试剂时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。
4. 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。
5. PCR反应条件
最适的PCR条件因PCR扩增仪的不同而不同，建议在进行样品实验前先试做一下Control实验。
6. 引物选择
用于反转录的引物可视实验具体情况选择Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer或特异性下游引物。对于不具有Hairpin构造的短链mRNA，3种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进行选择。 |
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Random 9 mers
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适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
用Random 9 mers合成的cDNA进行PCR反应时，使用任何一对特异性引物都能获得良好的扩增。 |
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Oligo dT-AdaptorPrimer
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适用于具有Poly(A)+ Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物Primer 的rRNA及tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不具有Poly(A)+ Tail)。本Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后，可用M13 Primer M4进行3’-RACE实验。 |
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特异性下游PCR Primer
(PCR时的下游引物)
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因其必须与模板序列互补，所以只适用于Target序列已知的情况。 |
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