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■ 制品内容 (50 次量*1) |
PrimeScript II RT Enzyme Mix |
50 μl |
5×PrimeScript II Buffer |
200 μl |
dNTP Mixture (10 mM each) |
100 μl |
Oligo dT Primer (50 μM) |
50 μl |
Random 6 mers (20 μM) |
50 μl |
PrimeSTAR GXL for RT-PCR |
100 μl |
5×PrimeSTAR GXL Buffer |
500 μl |
Control F-1 Primer*2 (20 μM) |
10 μl |
Control R-1 Primer*3 (20 μM) |
10 μl |
Positive Control RNA (2×105 copies/μl) |
20 μl |
RNase Free dH2O |
1ml |
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*1 反转录反应20 μl、PCR反应50 μl,2 Step RT-PCR时可使用50次。 *2 Positive Control RNA用上游引物。 *3 Positive Control RNA用下游引物。 |
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■ 制品说明 |
PCR (Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应) 是一种使用两种引物扩增目的DNA的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA,RNA不能直接被扩增,但是经过反转录酶的作用将RNA反转录成cDNA后扩增 (RT-PCR),PCR法便可应用于RNA的解析了。目前,此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit是一种对长链RNA及富含GC序列的RNA合成cDNA时具有高保真性的RT-PCR用试剂盒。 本试剂盒中使用的PrimeScript II反转录酶是改良型的PrimeScript RTase,可在合成长链cDNA时发挥效力,同时PCR时使用了对长链及富含GC序列的cDNA扩增时具有高保真性的DNA聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase。因PrimeScript II RTase可很好地抑制由于引物错配引起的非特异性扩增,即使使用高浓度的Oligo dT Primer进行反转录反应也不会导致cDNA合成时的阻害作用,因此使用高浓度的RNA作为模板也可进行良好的反转录反应。 本试剂盒中使用PrimeScript II RTase与RNase Inhibitor的混合型PrimeScript II RT Enzyme Mix。另外,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase克服了以往的高保真酶由于核酸浓度过高而存在的反应阻害性,在高浓度核酸存在条件下也能发挥其效力,可以在更宽广的RNA模板范围内获得cDNA扩增产物。 本试剂盒具有以下优点: 1. 能够从长链RNA及富含GC序列的RNA中获得错配率很低的cDNA扩增产物。 2. 在42℃条件下反转录反应也可以使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸。 3. 反应体系中Total RNA的使用范围非常宽广,便于使用。 本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需要的全部试剂。并且,也可以进行1 Step RT-PCR反应。 |
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■ 各种引物的序列 |
引物名称 |
各引物序列 |
Random 6 mers |
Pd (N)6 |
Oligo dT Primer |
Takara独自开发的dT区域的序列 |
Control F-1 Primer |
5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ |
Control R-1 Primer |
5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ |
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■ Positive Control RNA |
本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段,DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。 |
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图1. Control RNA:使用Control Primer时所能扩增的DNA片段 |
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■ 保存 |
-20℃。 |
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■ 使用注意 |
1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时,应先配制各种试剂的混合液 (Master Mix;其中包括RNase Free dH2O、Buffer、dNTP Mixture等),然后再分装到每个反应管中。这样,可使所取的试剂体积更准确,减少试剂损失,避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2. 使用PrimeScript II RT Enzyme Mix、PrimeSTAR GXL for RT-PCR等酶类产品时,应轻轻混匀,避免起泡;分取之前要小心地离心收集到反应管底部;由于酶保存液中含有50%的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。 3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出,使用后也应立即放入-20℃保存。 4. 为了防止Positive Control RNA分解,应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃~-80℃。 5. 分装试剂时务必使用新的枪头 (Tip),以防止样品间污染。 |
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