pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector酶试剂盒Takara

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pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector
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Takara 6012 pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector 1.0 μg ￥410 pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector
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■ 制品内容
pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector (50 ng/μl) 20 μl × 1 支
Control Insert 2 (50 ng/μl)* 10 μl × 1 支
   
* 本DNA片段与EcoR V酶切载体连接后，可以使用EcoR V切下DNA片段。
 
■ 制品说明
pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector是一种高效克隆末端平滑PCR产物的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成，它消除了pUC19载体上的多克隆酶切位点，再在多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V将其切成末端平滑的线性DNA后，进行了5′末端的去磷酸化处理，以避免克隆DNA片段时产生大量载体自连现象。
本载体尽管消除了LacZ基因上的多克隆酶切位点，但不影响 β-半乳糖苷酶的正常表达，PCR扩增片段克隆于载体后仍可以利用α-互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性克隆。
有很多高保真DNA聚合酶，如：Takara PrimeSTAR HS、Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu等，其扩增的DNA片段为平滑末端，可以方便使用本载体进行DNA克隆。由于本载体的5’ 末端进行了去磷酸化处理，如果PCR扩增片段的5’ 末端不带磷酸基团时，应对其进行5’ 末端磷酸化处理后再使用本载体进行DNA克隆。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，当PCR产物使用本载体进行DNA克隆时，将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。此时如果使用PCR扩增引物导入的酶切位点进行DNA酶切时，酶切反应将不会受到载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率，增加亚克隆成功率。
本制品的β-半乳糖苷酶的表达活性高，菌落显示蓝色的时间短，菌落显示的蓝色深。因此，克隆后容易进行克隆体的蓝白筛选。
本载体同样可以用于末端平滑的其他DNA片段的克隆。
 
■ 保存
-20℃。
 
■ 纯度
Control Insert2经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
 
■ 用途
1. 平滑末端PCR产物的克隆。
2. 其他平滑末端DNA片段的克隆。
3. 对克隆后的DNA片段使用BcaBEST Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
 
■ pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector的结构
pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector
 
■ 注意事项
1. 由于载体上的多克隆酶切位点被破坏，所以使用本载体克隆PCR产物时，注意应在PCR引物上设计导入酶切位点，否则将会难以切下DNA片段进行其它亚克隆实验。
2. 为了避免载体自连，本载体进行了去磷酸化处理，因此Insert DNA片段的5′端必须保证带有磷酸基团，否则无法进行连接。Takara PrimeSTAR HS、Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等DNA聚合酶扩增的PCR片段须经过磷酸化处理后才能进行连接反应(引物的5′端进行磷酸化标记时除外)。
3. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR产物) 建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA (甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响克隆效率。
4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr. GenTLE Precipitation Carrier (Code No.: 9094) 可以提高DNA的回收率。
5. 连接反应请在25℃以下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。
6. 本制品来源于pUC19载体，因此，适合pUC19载体的感受态细胞都可以使用，如: JM109等。