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| ■ 制品内容 (20 次量) |
| Pyrobest DNA Polymerase (5 U/μl) |
15 μl |
| 10×Pyrobest Buffer II |
200 μl |
| dNTP Mixture (2.5 mM each) |
180 μl |
| 10×Blunting Kination Buffer |
50 μl |
| Blunting Kination Enzyme Mix |
25 μl |
| Ligation Solution I* |
150 μl |
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| * Ligation Solution I 即为Ligation Kit Ver.2.1 的一种组份。 |
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| ■ 制品说明 |
本制品是利用PCR技术进行定点突变操作的试剂盒。其原理是利用导入变异点的引物进行PCR反应后，对PCR产物进行末端平滑化及5’磷酸 (P) 化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接 (环化反应)，然后转化、提取突变体DNA。
本试剂盒的原理十分简单，但Taq酶在PCR过程中的错配率限制了这一技术的应用。现在，Takara的Pyrobest DNA Polymerase使这一技术得到了很好的发挥。Pyrobest DNA Polymerase不仅具有很高的保真性（Fidelity），并且和TaKaRa Taq具有同样的扩增效率。与其他突变试剂盒相比，本试剂盒的特点是操作方便、简单，只需一天时间便可完成整个操作，并且不受载体、宿主菌的限制。 |
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ TaKaRa MutanBEST Kit原理 |
试剂盒原理见下图，全套操作约需5小时，简单说明如下。
1. 设计一对5’端邻接，3’端方向相反的引物用以导入变异点。
2. 进行PCR扩增 (使用高保真DNA聚合酶Pyrobest DNA Polymerase)。
3. PCR片段的末端平滑及5’末端磷酸化反应 (在同一反应体系内进行，反应只需10分钟)。
4. 自身连接反应 (使用本试剂盒中的DNA高效连接液Ligation Solution I，连接反应只需30 分钟至1小时)。
5. 质粒DNA转化，挑选变异体。 |
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| ■ 注意事项 |
1. 当载体与插入的DNA片段的总长度小于5 kb时，使用本试剂盒较为合适；如果载体与插入DNA 片段长度太长时，不推荐使用本试剂盒。
2. PCR反应后的DNA片段应进行切胶回收纯化，然后再进行自身连接反应，这样可以提高突变成功率。
3. Ligation Solution I请于冰中融解，使用前混匀。应避免多次反复冻融。
4. 连接转化效率低时，请试用下述方法进行改进。
① 确认感受态细胞的转化效率。
② 延长连接反应时间至过夜反应。 |
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