SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit酶试剂盒Takara

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SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
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SMARTer® Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
捕获人的BCR转录本完整V(D)J 可变区
· 起始样品量: 从外周血单核细胞（PBMC）纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA
· 通过添加UMI，校正来自PCR错误、重复序列以及序列错误的读取
· cDNA文库构建经过优化，可以灵敏、特异地检测克隆型
· 可准确扩增并通过测序鉴别人IgG亚类
· 经过优化的PCR pooling策略，可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
· 灵活的pooling策略适用于不同的实验需求，以比对、识别原始链序列
· 可以使用Cogent NGS Immune Profiler Software进行序列数据分析的完整工作流程
 
新推出的SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术，提供了一种灵敏，准确，优化的BCR库分析方法。通过5’RACE方法减少了变异性并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。该试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合可以捕获BCR完整V(D)J可变区，提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。
该试剂盒设计的可以从外周血单核细胞（PBMC）纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA，生成Illumina文库。可以为人免疫球蛋白IgG和IgM的重链和轻链（κ和λ）生成数据。该试剂盒还包括特别的分子条形码（UMI），从而可以消除PCR错误或duplication以及测序偏向，从而确保获得更准确和可靠的结果。
测序结束后，可以使用Takara Bio Immune Profiler Software分析数据，该软件使用基于UMI的纠错功能，并可以使用MIGEC（Shugay，2014年）和MiXCR软件（Bolotin，2015年）。该软件支持高质量的BCR分析，包括克隆型计数和鉴别以及V(D)J区域的序列信息。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图1. SMARTer Human BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程
 
Panel A 第一链cDNA合成由dT引物（RT引物）起始，MMLV衍生的SMARTScribe反转录酶会在mRNA模板5’末端添加几个非模板核苷酸。SMART UMI Oligos与这几个非模板核苷酸互补结合作为模板，通过RT在第一链cDNA末端添加额外核苷酸序列（也就是模板转换步骤）。然后第一链cDNA经过两轮基因特异性的PCR扩增（详见Panel B）。第二轮的巢式PCR扩增可以确保绝大多数的reads比对到B细胞受体的转录本上。
 
Panel B 第一轮PCR以第一链cDNA为模板，引物包括与Illumina Read Primer 2序列互补的正向引物（PCR1 Universal Forward primer），以及与BCR重链或轻链恒定区互补的反向引物（PCR1 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）。以Read Primer 2序列和恒定区起始，第一轮PCR特异性扩增了BCR重链或轻链cDNA的完整可变区及部分恒定区。第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，采用半巢式引物（PCR2 IgG/IgM/IgK/IgL Reverse primers）扩增BCR重链或轻链的cDNA的完整可变区及部分恒定区。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图2. 从1-100 ng B细胞RNA中鉴定出的克隆型信号
 
从1 ng，10 ng和100 ng人CD19 + B细胞总RNA中，利用本试剂盒制备BCR分析IgG，IgM，IgK和IgL文库。为了进行分析，对于1 ng，10 ng和100 ng的RNA起始，分别将文库down-sampling至100,000个，400,000个和5,000,000个reads，然后利用Takara Bio Immune Profiler Software处理。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图3. 散点图展示了用1μg PBMC RNA生成的文库之间的一致性
 
以来自健康供体的1μg PBMC RNA起始，一式两份制备IgG，IgM，IgK和IgL文库。通过down-sampling至1300万次读取来分析该文库。该图包括来自技术重复的所有四个文库（IgG，IgM，IgK和IgL）。
 
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
图4. 来自不同供体的PBMC RNA的克隆型计数
 
对来自8个供体的10 ng PBMC RNA（不同颜色代表不同供体），分别使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit来鉴别IgG，IgM，IgK和IgL的克隆型。文库归一化为100,000 reads以进行分析。
 
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图5. 10 ng PBMC RNA文库的测序饱和度评估
 
以来自单个供体的10 ng PBMC RNA起始，使用SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Kit制备BCR分析文库。
 
Panel A 显示了不同测序深度的IgG克隆型计数，其中蓝线和紫线分别是指经过UMI修正误差和没有经过UMI修正误差的数据。IgG和其他链（IgM，IgK和IgL未在图中展示）按每个文库150万个读数进行测序，然后通过down-sampling至1,000K，500K，200K，100K，50K，10K和5K reads。使用Takara Bio Immune Profiler Software分析不同测序深度的结果。
 
Panel B 维恩图显示了低测序深度（100K）和高测序深度（1,500K）的文库之间重叠的克隆型。
 
 
 
 
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