| 基因敲入用长单链DNA制备 v1 | ||||||
| 品牌 | Code No. | 产品名称 | 包装量 | 价格（元） | 说明书 | 数量 |
| Clontech | 632644 | Guide-it Long ssDNA Production System | 25 Rxns | ￥5,654 |  |
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| Clontech | 632645 | Guide-it Long ssDNA Strandase Kit | 25 Rxns | ￥4,159 | |
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| 基因敲入用长单链DNA制备 |
| CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变（knockout），但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。 虽然单链DNA（ssDNA）修复模板展示出了优于双链DNA（dsDNA）模板的众多优势，但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性，因而限制了长单链DNA（long ssDNA）模板的应用。Guide-it Long ssDNA Strandase Kit可以很好地解决这个矛盾，可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸，应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），将其转化为单链DNA。该试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂（25对正义链和反义链）。 |
| 与dsDNA相比，使用ssDNA作为模板的优势： |
| · 显著降低了随机整合到基因组中的概率，从而提高了基因编辑效率 · ssDNA模板导入产生的细胞毒性反应低 · 不存在随机整合或者表达，提高了基因编辑效率 · 非整合模板中不表达，更容易识别发生正确基因编辑的细胞克隆 |
| 注意：Guide-it Long ssDNA Production System包含NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up kit，用于在基因编辑实验之前纯化strandase反应液。 |
| ■ Overview |
| · 制备长达5 kb的长单链DNA（ssDNA）供体模板 · 三步操作，快速，简便易用 · 不存在随机整合或者表达，从而提高了基因编辑效率 · 单链DNA供体模板产生的细胞毒性远低于双链DNA模板 |
| ■ 应用 |
| · 制作基因敲入实验供体模板，DNA片段> 500 bp |
| ■ 操作流程概要 |
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| 图1. 同源定向修复（Homology Directed Repair）实验用长单链DNA（long ssDNA）供体模板制备步骤示意图。第一步，通过合适的方法（克隆，融合PCR等）制作dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。第二步，通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A，开始消化降解正义链或反义链（Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链）。第三步，添加Strandase Mix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。 |
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