• 1.PCR反应体系的设置：
  • a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。将Hot-Start Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒内。
  • b.参考下表在冰浴上设置PCR反应体系(如果有多个类似的PCR反应，可以先配制大体积的包含水、buffer、dNTP和Hot-Start Taq酶的混合物，然后分装到各PCR反应管内。根据情况，有时混合物中可以包括引物)：
    

    试剂	最终浓度	体积
    双蒸水或Milli-Q水	–	(36.5-x)μl
    10X Hot-Start PCR Buffer	1X	5μl
    dNTP (2.5mM each)	0.2mM each	4μl
    模板DNA	10pg-1μg*	xμl
    引物混合物(10μM each)	0.8μM	4μl
    Hot-Start Taq DNA Polymerase (2.5U/μl)	1.25U/50μl	0.5μl
    总体积	–	50μl

    • 注意：(a)通常引物的终浓度为0.2μM时可获得良好的检测效果，也可以根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度。
    •           (b)对于不同类型的模板在50μl反应体积中推荐用量如下：哺乳动物基因组DNA：0.1-1μg；大肠杆菌基因组DNA：10-100ng；质粒DNA：0.1-10ng。过多的模板DNA容易导致非特异性的PCR产物。
  • c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
  • d. 如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(mineral oil，ST275)。
  • e. 把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。
• 2. PCR反应参数的设置可以参考如下示例：
  • STEP1(起始变性): 94℃ 3min
  • STEP2(变性): 94℃ 30sec
  • STEP3(退火): 55℃ 30sec
  • STEP4(延伸): 72℃ 1min
  • STEP5(循环): Go To STEP2 for 30 cycles
  • STEP6(最终延伸): 72℃ 10min
  • STEP7(临时保存): 4℃ forever

注意：

• a.PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间和循环数等。
• b.STEP4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。
• c.对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进行半定量反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。

常见问题：

• 1.PCR产物非常少或没有特异性条带。
  • a.引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。
  • b.待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时可以使用适合扩增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相应地根据GC-rich buffer的要求或说明调整PCR反应参数的设置。
  • c.长片段扩增。尽管Hot-Start Taq DNA Polymerase可以扩增最长达8kb的DNA片段，但大多数时候比较适合扩增3kb以下的片段，更长片段的扩增推荐使用其它更适合长片段扩增的DNA聚合酶。
  • d.PCR反应设置时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上设置PCR反应。
  • e.由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时可以采用Touch down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
  • f.退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有温度梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。
  • g.延伸时间不足。可按照每1kb片段延伸1分钟进行设置，对于较难扩增的片段可以设置为每1kb片段延伸1.5-2分钟。
  • h.待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
  • i.在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。
  • j.循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。
  • k.模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内侧再设计一对PCR引物，然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这样一方面可以起到扩增作用，同时也可以从第一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不能去除非特异性条带。
  • l.模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
  • m.当产生较多非特异性条带时，可以适当提高退火温度。
  • n.注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

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