BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) |
产品编号: D7182M |
产品包装: 100次 |
产品价格: 436.00元 |
产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
D7182M | BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) | 100次 | 436.00元 |
上海金畔生物科技有限公司生产的BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X),即BeyoRT™ III First Strand cDNA Synthesis Master Mix (5X),是一种仅需加入RNA模板和水就能进行反转录的最简单、便捷、快速、稳定并且非常高效的cDNA第一链合成产品。本产品对于3kb以下片段,10min就能完成反转录;产物长度可以长达12kb;可以在55℃进行高温反转录,有效解决复杂二级结构RNA反转录难的问题;-20℃不会结冻,取用非常便捷。
BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)包含了经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer、Random Hexamer Primer、dNTPs、MgCl2和反转录反应缓冲液,只需加入RNA模板和水(DEPC-treated Water或DNase/RNase-Free Water)就能进行反转录反应,大大简化了反转录的实验操作,使操作最为便捷,能有效避免常规反转录非常复杂的操作过程中可能导致的操作误差、孔间污染等,使反转录的重复性和平行性大幅提升。
本产品可广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成,后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR (quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建,尤其是反转录所得目的基因的克隆等。BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等,也可以通过引物延伸(primer extension)来分析和研究RNA。
BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)中的BeyoRT™ III M-MLV reverse transcriptase,是一种经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的M-MLV反转录酶,具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性,能够以RNA或DNA为模板,在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成,即可以进行cDNA(complementary DNA)的第一链合成,同时它保留了RNase H的活力,能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA,有利于后续cDNA第二链的合成。
本产品经测试可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录,反转录的最大长度可以达到12 kb。BeyoRT™ III M-MLV反转录酶热稳定性好,反转录效率高。本产品最适反应温度为42℃,当温度达到50℃时仍具有很高活性,对于长度较短的cDNA反转录,温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录,能有效减少二级结构,提升反转录效率。反转录速度快,6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成,3kb以下的cDNA反转录10min即可完成。
本产品反转录效率高,BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)的反转录效率与非预混液的反转录效率一致(参考图1)。
图1. 使用上海金畔生物科技有限公司的BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)和使用BeyoRT™ III M-MLV反转录酶的常规反转录体系的效果对比图。在20μl的反转录反应体系中,以HEK293T细胞中提取的1µg总RNA为模板,没有加入反转录酶、分别使用BeyoRT™ III M-MLV反转录酶的常规反转录体系和BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X),42℃反转录60min。然后取1μl反转录产物分别进行两个目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳检测。
如果希望进行常规的反转录操作,可以单独选购BeyoRT™ III M-MLV反转录酶(D7176),RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373),或者选购BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒(D7178)进行反转录反应。
本产品操作便捷,作为即用型第一链合成预混液(5X),即反转录预混液(5X),只需加入模板RNA和水,即可快速进行反转录反应,并且BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X)在-20℃不会结冻,使用非常便捷。
本产品重复性好,反转录所有试剂预混合,大大减少操作步骤,有效降低污染几率和操作误差,使实验结果更加一致,重复性更好。
失活或抑制:80℃孵育10min可以导致本产品中的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ III M-MLV反转录酶有抑制作用。
本试剂盒的不同包装分别足够进行20次、100次和500次反转录反应。
包装清单:
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D7182S | BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) | 80μl |
D7182M | BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) | 400μl |
D7182L | BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) | 2ml |
— | 说明书 | 1份 |
保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
对于GC含量比较高的RNA的反转录,产品的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明
使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis):
a. 参考如下表格中设置的20μl反转录体系:
RNA | Total RNA | 0.1ng-5µg |
或poly(A) RNA/mRNA | 10pg-0.5µg | |
或specific RNA | 0.01pg-0.5µg | |
DEPC-treated Water | - | To 16μl* |
选择性步骤:如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构,混匀后微离心以把液体沉降至管底,65℃孵育5min,随后立即置于冰上冷却,以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。 | ||
BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液 | - | 4μl |
总体积 | - | 20μl |
*To 16μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为16μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 42℃孵育10-60 min。反转录3kb以下的cDNA,反转录10min即可,反转录3-6kb的cDNA,反转录30min即可,而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。后续用于qPCR时,检测任何长度的基因,通常反转录10min就足够了。注意:对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA,可以50℃反转录60 min,以充分利用本产品反转录酶在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点,在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活反转录酶并终止反转录反应。说明:对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶,该方法易导致部分长片断DNA被剪切,此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为20μl和50μl,则推荐相应地使用0.8μl和2μl反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。
常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
a. 反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,并且总RNA的反转录产物大小很不均匀,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0,则提示总RNA发生了显著的降解,最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是,严格进行RNA的相关操作,包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA,以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用上海金畔生物科技有限公司的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增,通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构,此时可以考虑把反转录温度提高到45-55℃。
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D7160L | BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) | 200KU |
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D7168S | BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) | 20次 |
D7168M | BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) | 100次 |
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D7226 | GC-rich PCR Buffer(4种套装) | 共2ml |
D7228 | 2X PCR Master Mix | 400次 |
D7232 | PCR Kit with Taq | 400次 |
D7233 | PCR Kit with Taq | 2000次 |
D7237 | PCR Kit with BeyoTaq | 400次 |
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D7255 | Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X) | 400次 |
D7259 | Easy-Load™ PCR Master Mix (Orange, 2X) | 400次 |
D7371 | dNTP Mixture(2.5mM each) | 1ml |
D7373 | dNTP Mixture(25mM each) | 250μl |
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