使用说明：
1. 去除RNA样品中的基因组DNA。
a. 将模板Total RNA，5X gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5X RT Buffer、10X RT Primer Mix、DEPC-treated Water在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。
b. RNA的变性(可选做)，把RNA样品在65℃条件下热变性5 min后，立即置于冰水中冷却。经过本步骤处理后，对于容易形成高级结构的RNA可以有效提高反转录的效率。初次实验时，建议对于是否需要变性进行摸索。注意：进行本步骤操作时，请不要添加gDNA Eraser Buffer。
c. 按下表成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按照反应数+1的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

*常规的20μl反转录反应体系，可使用10pg到1μg的Total RNA，建议使用0.5-1μg的Total RNA。
d. 在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2min。迅速置于冰上放置。
2. 反转录反应
a. 2X Master Mix的配制：反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1的量配制Master Mix，然后分装10μl到每反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。按照下表的反转录反应体系配制混合液。如果经常进行反转录实验，为了方便操作，可以预先将5X RT Buffer和10X RT Primer Mix进行2:1混合，该混合液可在-20℃稳定保存。

*含Mg²⁺和dNTP。
**Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物。
***含RNase Inhibitor。
b. 将上一步骤配制好的2X Master Mix，分装10 μl到步骤1所得的10μl反应产物中，充分混匀。
c. 42℃孵育60 min以进行反转录反应，随后80℃孵育10 min失活反转录酶后放于冰上。
注意：对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高反转录温度至50℃，以增强逆转录效率。
d. 得到的cDNA可立即或-20℃冻存后用于qPCR、常规PCR等后续实验。-20℃冻存的cDNA样品，通常宜在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA宜避免过多的反复冻融。

常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带及qPCR检测无信号，或信号出现延迟
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用上海金畔生物科技有限公司的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. qPCR检测无信号或是信号出现延迟，有可能是由于配制反转录体系时，忘记添加某种试剂；使用了错误的反转录体系； qPCR体系中的反转录产物添加过多，并干扰了PCR反应，通常添加到PCR反应体系中的反转录反应产物最好能控制在10%以下，实际qPCR时的用量会更少。有些RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-50℃。

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