使用说明：
1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，融解后立即置于冰上并混匀。第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液于-20℃保存。如果最终目的是制备线粒体蛋白，根据样品数量，取适量相应的线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到组织样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。同时，根据样品数量取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 从软组织(例如肝脏和脑)中分离线粒体：
a. 使用新鲜的动物组织，通常要求动物处死后不超过一小时，并且保存在冰上的组织。请勿使用经过冷冻保存的组织。
b. 剪取一小块组织，重量约为50-100mg。在1.5ml离心管内对剪取的组织进行称重。用PBS洗涤组织一次。
c. 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。
d. 加入10体积预冷的线粒体分离试剂A或临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂A，在冰浴上进行匀浆，匀浆10次左右。注：如果组织的重量为80mg，可以大致认为组织的体积接近80微升，此时需加入800微升线粒体分离试剂A。
e. 把匀浆在600g，4℃离心5分钟。
注：如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为1000g，其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
f. 小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10分钟。
注：如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为3500g，其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
g. 小心去除上清。沉淀即为分离得到的线粒体。
注：如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，在本步骤需收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g，4℃离心10分钟。取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。该细胞浆蛋白如果需要测定蛋白浓度，必须使用PBS或生理盐水至少稀释2倍，然后才能用BCA法或Bradford法进行检测(须特别注意，标准品也需要配制在含有相应比例线粒体分离试剂的PBS或生理盐水中)。
3. 从硬组织(例如心肌和骨骼肌)中分离线粒体：
a. 对于心肌组织采用线粒体分离试剂A，对于骨骼肌组织采用线粒体分离试剂B，对于其它类似组织可以优先考虑使用线粒体分离试剂A，如遇到效果不佳的情况可以试用线粒体分离试剂B。
b. 使用新鲜的动物组织，通常要求动物处死后不超过一小时，并且保存在冰上的组织。请勿使用经过冷冻保存的组织。
c. 剪取一小块组织，重量约为50-100mg。在1.5ml离心管内对剪取的组织进行称重。用PBS洗涤组织一次。
d. 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。
e. 加入10体积预冷的PBS，冰浴3分钟。注：如果组织的重量为80mg，可以大致认为组织的体积接近80微升，此时需加入800微升PBS。
f. 600g离心10-20秒，沉淀组织样品，弃上清。
g. 再加入8体积预冷的胰酶消化液，冰浴20分钟。
注：如果组织的重量为80mg，此时需加入约640微升相应的胰酶消化液。
h. 600g离心10-20秒，沉淀组织样品，弃上清。
i. 加入2体积相应线粒体分离试剂，重悬组织，用于洗去残余的胰酶。
注：如果组织的重量为80mg，此时需加入约160微升线粒体分离试剂。
j. 600g离心10-20秒，沉淀组织样品，弃上清。
k. 加入8体积预冷的相应线粒体分离试剂或临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂，在冰浴上进行匀浆，匀浆20-30次。
注：如果组织的重量为80mg，此时需加入约640微升相应的线粒体分离试剂。
l. 把匀浆在600g，4℃离心5分钟。
注：如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为1000g，其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
m. 小心把上清转移到另一离心管中，在11,000g，4℃离心10分钟。
注：如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为3500g，其它离心条件不变；获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
n. 小心去除上清。沉淀即为分离得到的线粒体。
注：如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，在本步骤需收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12,000g，4℃离心10分钟。取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。该细胞浆蛋白如果需要测定蛋白浓度，请参考步骤2g。
4. 线粒体的使用：
a. 如果用于完整线粒体的功能或酶活性研究，可以加入适量线粒体储存液，重悬线粒体。通常每100mg组织获得的线粒体可以用40微升相应的线粒体储存液重悬，预期分离获得的线粒体样品的蛋白浓度为10-20mg/ml。该蛋白样品可以使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度。
b. 如果用于线粒体的蛋白分析，初始重量为50-100mg的组织样品分离得到的线粒体样品中可以加入150-200微升临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体。裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP以及线粒体中的一些酶活性的测定等。裂解后的蛋白样品可以使用BCA法或去垢剂兼容型Bradford法(P0006C)测定蛋白浓度。
c. 如果用于双向电泳，请使用适当的用于双向电泳的裂解液处理线粒体。

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