| Caspase 8 活性检测试剂盒 |
| 产品编号: C1152 |
| 产品包装: 100次 |
| 产品价格: 1811.00元 |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| C1152 | Caspase 8 活性检测试剂盒 | 100次 | 1811.00元 |
Caspase 8 活性检测试剂盒(Caspase 8 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 8酶活性或纯化的caspase 8酶活性的试剂盒。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 8也称
FLICE、MACH或Mch5，有时被写作caspase-8或caspase 8，通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活。Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活，形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。
本Caspase 8活性检测试剂盒是基于caspase 8可以催化底物Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Aspp-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
试剂盒中提供了caspase 8催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 8酶活性的标准品。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测100个样品。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| C1152-1 | 裂解液 | 30ml |
| C1152-2 | 检测缓冲液 | 10ml/瓶，共2瓶 |
| C1152-3 | Ac-IETD-pNA(2mM) | 200μl/管，共5管 |
| C1152-4 | pNA(10mM) | 1ml |
| — | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存，Ac-IETD-pNA和pNA需避光保存。
注意事项：
须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。
Ac-IETD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)，可向上海金畔生物科技有限公司订购。建议样品用水稀释1倍后再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。
pNA(中文名为4-硝基苯胺)对人体有毒，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。pNA(10mM)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
本试剂盒的裂解液可以和上海金畔生物科技有限公司生产的其它caspase活性检测试剂盒的裂解液通用，即本试剂盒裂解液制备的蛋白样品可以用于上海金畔生物科技有限公司其它caspase活性检测试剂盒的检测。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明
|
使用说明： 3.样品的收集： |
| 空白对照 | 样品 | |
| 检测缓冲液 | 40μl | 40μl |
| 待测样品 | 0μl | 50μl |
| 裂解液 | 50μl | 0μl |
| Ac-IETD-pNA(2mM) | 10μl | 10μl |
| 总体积 | 100μl | 100μl |
注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μl Ac-IETD-pNA(2mM)。
c.加入Ac-IETD-pNA(2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
d.样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 8催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
e.参考Chemicon公司的caspase 8酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-IETD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-IETD-pNA产生1nmol pNA的caspase 8的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 8。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 8酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
f.用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 8的酶活力单位。
常见问题：
1.测定出的A405过低：
A.样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度至少达到1-3mg/ml。
B.样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。
2.测定出的A405过高或者样品量不足：
测定出来的A405读数过高时，可以参考下表的反应体系适当减少样品的用量；样品量不足时也可以参考下表减少样品的用量。
| 空白对照 | 样品 | |
| 检测缓冲液 | 40μl | 40μl |
| 待测样品 | 0μl | xμl |
| 裂解液 | 50μl | (50-x)μl |
| Ac-IETD-pNA(2mM) | 10μl | 10μl |
| 总体积 | 100μl | 100μl |
说明：其中x不超过50，其余检测方法同上面的使用说明所述。
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