使用说明：
1. Bacmid转染：
a. 昆虫细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：按照每孔约80万Sf9或Sf21细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)用正常的细胞培养液接种到六孔板内，使细胞密度能达到约70-90%。在27-28℃培养，后续转染和培养也在该温度下进行。
b. 15分钟后，将正常的细胞培养液更换为平板培养液(含1.5%胎牛血清不含抗生素的SFX-INSECT培养液)每孔0.8ml。
c. 参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入100μl不含血清和抗生素的SFX-INSECT昆虫细胞培养液用于稀释bacmid和转染试剂。其中一管加入16μg bacmid，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入8μl LipoInsect™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，或者轻微Vortex混匀，但不可离心。稀释的bacmid和转染试剂室温静置约2-5min(最多不得超过30分钟)。随即把稀释的bacmid用移液器轻轻加入到稀释的LipoInsect™转染试剂中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15-30分钟。

注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Bacmid用量建议在8-24μg范围内进行适当调节。最佳的转染条件，不同的细胞类型和培养条件有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
注2：Bacmid的浓度在稀释前宜控制在0.5-5μg/μl范围内。
注3：对于多个孔转染相同数量相同bacmid的情况可以把这些孔所需的DNA混合物和LipoInsect™转染试剂分别合并在一起稀释，然后把稀释好的bacmid滴加到稀释好的LipoInsect™转染试剂中，混匀并室温放置30分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积(参考附录2)按比例进行换算。

d. 按照六孔板每孔200μl LipoInsect™转染试剂-bacmid混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
e. 为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养3-5小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Sf9细胞，推荐在转染4小时后更换培养液)。
f. 继续在27-28℃培养约96小时后，收集每孔的培养液，500g离心5分钟，获得的上清即为P1代杆状病毒(病毒滴度通常为1×10⁶~1×10⁷ pfu/ml)。P1代病毒4℃避光保存，如果包装病毒时的细胞培养液为无血清培养液宜添加胎牛血清至终浓度为2%以保护病毒被蛋白酶降解。P1代病毒近期不使用的情况，可以适当分装后-80℃长期保存。尽量避免反复冻融病毒，反复冻融可能导致病毒滴度下降10-100倍。
g. 为获得更高滴度的杆状病毒，可以使用P1代病毒感染Sf9或Sf21细胞等来获得P2代杆状病毒(病毒滴度通常为1×10⁷ ~1×10⁸pfu/ml)。具体操作请参照昆虫细胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的相关操作规程。大致的步骤为使用P1代病毒感染2×10⁶个贴壁约1小时的Sf9或Sf21细胞，推荐的病毒的MOI为0.05-0.1，过高的MOI会导致获得的病毒质量下降。27-28℃培养48小时后，同步骤f收集每孔的培养液，随后500g离心5分钟，获得的上清即为P2代杆状病毒。P2代病毒的保存条件同P1代。由于杆状病毒在每一代的扩增过程中均易出现缺少突变，因此推荐最多扩增至P3代病毒。

常见问题：
1. 转染效率低：
a. 优化bacmid与LipoInsect™转染试剂比例，对于难转染的细胞，可适当加大质粒用量。
b. 使用高纯度、无菌、无污染物的bacmid进行转染，DNA纯度方面A₂₆₀/A₂₈₀比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用上海金畔生物科技有限公司生产的质粒抽提试剂盒中的溶液I、II、III，参考附录1进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
c. 昆虫细胞转染时状态良好，细胞密度达70-90%时才可进行转染，过稀或过密都可能影响转染效率，不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。
d. 需使用无抗生素和无血清培养液配制LipoInsect™转染试剂和bacmid的混合物。
e. 转染后培养时间不足，而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为72-96小时。
f. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。
g. 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。
2. 细胞毒性较大：
a. 缩短转染时间，在转染后较短时间内更换新鲜的细胞培养液。
b. 减少bacmid用量，按照比例减少LipoInsect™转染试剂。
c. 检查是否转染时细胞密度太低。

附录：
常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.
**These wells or dishes are square.

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