上海金畔生物科技有限公司生产的Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)是一种新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克隆试剂盒。本试剂盒利用包含了DNA 5′ 外切酶(5′ Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA连接酶(DNA
Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确
地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。
      和传统的基因克隆方法相比，本试剂盒的无缝克隆方法有多方面的突出优点：(1) 最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此是真正的”无缝克隆”；(2) 可通过一个反应将一个或多个片段快速、定向地插入到载体的任何位置；(3) 待插入的PCR扩增产物无须酶切；(4) 插入片段的大小范围宽，从20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通过PCR扩增获得线性化载体，因此限制性内切酶消化并不是克隆所必须的；(6) 酶催化的重组连接反应非常快速和高效，对于一个片段的插入仅需50℃处理15分钟；对于三个片段的插入仅需50℃处理30分钟，而对于5个片段的插入也仅需50℃处理约60分钟；(7) 只有插入片段和线性化载体的末端才能发生同源重组，可以有效避免非特异性的同源重组；(8) 阳性克隆比例高，单个DNA片段克隆的阳性率几乎为100%，三个片段的克隆阳性率约为70-80%。
      本无缝克隆试剂盒操作非常简单。本试剂盒进行基因克隆时没有酶切位点的限制，仅需在载体的预定克隆位点通过酶切进行线性化或通过PCR的方法直接制备线性化的载体，在插入片段的两个PCR引物的5′ 端引入与载体克隆位点两端完全一致的
15~25bp的重叠序列。重组反应可以在50℃快速进行，3-4小时内即可完成从DNA样品的PCR扩增、纯化、重组、到转化涂板的全部操作。其中PCR反应约2-3小时，PCR产物纯化约20分钟，重组反应15分钟，转化涂板约40分钟，共计约3-4小时即可完成。
      上海金畔生物科技有限公司无缝克隆试剂盒的工作原理示意图请参考图1。

       图1. 上海金畔生物科技有限公司无缝克隆试剂盒的工作原理图。重叠区域(overlap region)的DNA序列完全一致，通常长度为15-25bp。不同颜
色的重叠区域代表不同的重叠序列。在插入2个或以上片段时，不同的重叠序列可以确保待插入片段有序地插入到线性化的载体(linearized vector)中。
      本试剂盒中提供的linearized pUC18为通过EcoRI和BamHI双酶切制备。为检测本试剂盒的连接效率，试剂盒还提供了一个1100bp的DNA fragment, 通过使用pUC18的通用测序引物(M13 forward sequencing primer (5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´)和M13 reverse sequencing primer (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´))可对连接转化后的克隆进行菌落PCR扩增，扩增后得到1300bp的片段的克隆则为阳性克隆，而扩增后得到200bp的片段的克隆则为阴性克隆。
      本试剂盒用于一个1100bp片段的克隆和三个不同的1100bp片段的克隆，其重组反应产物转化DH5α感受态细胞后涂板获得的LB平板的实测效果参考图2A，菌落PCR鉴定结果参考图2B。

      图2. 本试剂盒用于无缝克隆的实测效果。A. 本试剂盒反应产物转化感受态细菌DH5α后涂板获得的LB平板效果图。在20μl反应体系中，将EcoRI和BamHI双酶切线性化的载体pUC18 (Linearized pUC18)，与通过PCR扩增的含有重叠序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:3)；或者与3个有适当重叠序列的不同的1100bp片段混合，pUC18载体与PCR片段的摩尔比为1:1:1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水补至20μl，50℃反应15min(插入一个片段)或30min(插入三个片段)。反应结束后，将反应产物放置在冰上5min，取5μl转化到100μl的DH5α感受态细菌中。对照组中只加入线性化的载体pUC18，同时也在50℃反应15min。实验结果表明，插入片段数目越多转化后得到的克隆数越少。B.菌落PCR鉴定用本试剂盒构建得到的克隆。实验结果表明，插入1个片段时的阳性率基本上为100%，插入3个片段时的阳性率约为70%左右。菌落PCR使用的是pUC18的通用测序引物M13 forward sequencing primer (5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´)和M13 reverse sequencing primer (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´)。
包装清单：

保存条件：
      -20℃保存，一年有效。
注意事项：
      单个片段的PCR产物进行重组反应时，如果PCR条带单一，可以无须纯化并直接进行重组反应，但PCR产物的体积不得超过重组反应体系的20%，并且重组效率通常会低于纯化后的PCR产物。
      对于多个片段的重组反应，重组效率通常会低于单个片段的重组效率，建议胶回收纯化后再进行重组反应。对于3个以上片段的重组反应或重组片段大于5kb时，强烈建议在胶回收后再进行重组反应。通常胶回收后，重组效率可提高2-10倍。
      单片段和线性化载体重组时，摩尔比至少为2:1。多片段和线性化载体重组时，各个片段和线性化载体的摩尔数宜保持一致。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

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      1M Tris-HCl, pH7.6 (Sterile, DNase free)，即无菌、无DNA酶污染的1M Tris-HCl, pH7.6，是一种经过高温高压灭菌并灭活DNA酶的常用缓冲液。本产品可以用于各种要求无DNA酶污染的生化、分子生物学等实验，也可以用于要求无菌的细胞培养等相关溶液的配制。
      Tris也称Tris base、Tris碱或2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1, 3-propanediol，分子式为C₄H₁₁NO₃，分子量121.14。本产品使用纯度>99.9%的Tris配制，并用盐酸调节pH至7.6后，经过高温高压灭菌和灭活DNA酶处理。
包装清单：

保存条件：
      室温保存。
注意事项：
      本产品为无菌产品，如需保持本产品的无菌状态，使用时请注意无菌操作。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

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上海金畔生物科技有限公司的InstantView™绿色荧光DNA上样缓冲液(6X, 溴酚蓝) (InstantView™ Green Fluorescent DNA Loading Buffer, 6X with Bromophenol Blue)是一种添加了高安全性绿色荧光染料NA-Green (Nucleic Acid Green)的DNA上样缓冲液，用于琼脂糖凝胶电泳时DNA、RNA等核酸样品的荧光染色和上样，核酸的荧光染色可以在与上样缓冲液混合的瞬间完成。
本产品使用便捷，染色上样一步完成：本产品中NA-Green的浓度经过优化，使用时直接加入适量本产品到核酸样品中混匀即可进行上样和电泳，无须在凝胶配制时加入任何核酸染料或者在电泳后进行染色，上样、染色同步进行，使用特别便捷。
本产品安全、灵敏度高、稳定性好：本产品中使用的NA-Green具有安全(致突变性极低且检测不到显著的细胞毒性)、灵敏度高(可检测低至0.6ng的DNA)、稳定性好(热稳定性和光稳定性好)等优点。本产品的灵敏度效果参考图1。

图1. 不同量DNA样品使用本产品的效果图。实际效果会因DNA质量、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品可以使用和SYBR Green或EB相同的荧光检测体系：使用本产品染色后在约500nm波长蓝光(也可以使用约260nm紫外光)激发呈现绿色荧光，适用于原先使用SYBR Green或SYBR Gold为核酸染料的凝胶成像和检测系统，例如对人体无害的蓝光灯或蓝光成像仪。对于原来用于EB染料观察的系统，可以考虑选用上海金畔生物科技有限公司的使用NA-Red染料的D0076 InstantView™红色荧光DNA上样缓冲液(6X, 溴酚蓝)或D0081 InstantView™红色荧光DNA上样缓冲液(6X, BeyoRed)，但也可以使用本产品。使用本产品并且用EB的紫外检测体系时，检测灵敏度会比使用NA-Red染料的产品低约4-5倍。对于既可以观察EB也可以观察SYBR Green的具有紫外和蓝光两种激发光的凝胶成像系统，则推荐直接使用本产品。
使用本产品时，宜配套使用D0116S/D0118S/D0121S/D0123S InstantView™绿色荧光DNA Ladder系列产品，或者把已有的添加了常规上样缓冲液的DNA ladder和D0153 InstantView™绿色荧光DNA Marker染料(50X)配套使用。本产品和DNA ladder配套使用的效果图参考图2。

图2. 不同长度的PCR产物样品使用本产品，并使用InstantView™绿色荧光DNA Ladder (D0121S)的电泳效果图。

本上样缓冲液以溴酚蓝为指示剂，稀释至1X后比重仍然较大，上样便捷、极易下沉，且颜色清晰可见。溴酚蓝的电泳的位置与200-500bp的DNA的电泳位置相近，在染色观察200-500bp DNA时，溴酚蓝可能对这些DNA片段的观察有一定干扰。如果溴酚蓝对所需要观察的条带有干扰，请使用D0083 InstantView™绿色荧光DNA上样缓冲液(6X, BeyoRed)。
如果待上样的样品的体积为10微升，则每个样品需使用2微升本产品，本产品共可以进行500次或5000次的染色和上样。
包装清单：

保存条件：
4℃避光保存，至少1年有效。长期不使用时，也可以-20℃避光保存。
注意事项：
      本产品作为荧光染料须避光保存，但在使用过程中的常规室内光照不会影响其使用效果。
本产品可直接加入DNA样品中进行上样和电泳。电泳之后的琼脂糖凝胶不建议重复使用。
电泳后的凝胶通常直接使用凝胶成像设备进行观察即可。如果发现背景偏高，也可以使用不含核酸酶的水洗涤背景。
本产品不仅可以染色双链DNA，也可染色单链DNA和RNA。
如果观察到条带弥散或者分离不理想，请尝试以下方法：使用新鲜配制的电泳缓冲液、降低核酸的上样量、降低琼脂糖浓度、选用更长的凝胶、降低电泳电压一倍以上并延长凝胶电泳时间以改善电泳效果、使用更薄的梳齿等。
本产品兼容常用的电泳缓冲液，例如TAE和TBE。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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