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| ■ 制品内容 (Code No. RR014A ; 50 次量*1) |
| PrimeScript RTase (for 2 Step) |
25 μl |
| 5 × PrimeScript Buffer |
200 μl |
| RNase Inhibitor (40 U/μl) |
25 μl |
| dNTP Mixture (10 mM each) |
150 μl |
| Oligo dT Primer (2.5 μM) |
50 μl |
| Random 6 mers (20 μM) |
50 μl |
| TaKaRa Ex Taq HS (5 U/μl) |
25 μl |
| 10 × PCR BufferⅡ |
250 μl |
| Control F-1 Primer*2 (20 μM) |
10 μl |
| Control R-1 Primer*3 (20 μM) |
10 μl |
| Positive Control RNA (2 × 105 copies/μl) |
20 μl |
| RNase Free dH2O |
1 ml |
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*1 反转录反应20 μl 、PCR反应50 μl体系时可使用50次。
*2 Positive Control RNA用上游引物。
*3 Positive Control RNA用下游引物。 |
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| ■ 制品说明 |
PCR (Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应) 是一种使用两条引物在目的DNA序列两侧扩增特异性DNA片段的过程。它是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法，但RNA不能直接被扩增。经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。目前，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
PrimeScript RT-PCR Kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的2 Step RT-PCR试剂盒。反转录反应使用了Takara Bio Inc.特别开发的M-MLV由来的新型反转录酶PrimeScript RTase；PCR反应使用了扩增性能良好的Hot Start 型DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS。本试剂盒具有以下优点：
1. 进行高效的RT-PCR扩增。
2. 在标准的RNA反转录反应温度 (42℃) 下，便可使具有复杂结构的RNA进行良好的延伸，可以避免RNA在高温条件下的降解。
3. 能有效抑制非特异性的PCR扩增。
本试剂盒含有反转录反应及PCR扩增反应所需的全部试剂。 |
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| ■ 各种引物的序列 |
| 引物名称 |
各引物序列 |
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Random 6 mers
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pd (N)6 |
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Oligo dT Primer
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Takara Bio特别设计的dT区域* |
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Control F-1 Primer
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5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ |
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Control R-1 Primer
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5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ |
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| * 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. : RR019A/B) 的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。 |
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| ■ Positive Control RNA |
| 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒 (质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kb的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因) 为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。 |
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| 图1. Positive Control RNA：使用Control Primer可以扩增462 bp的DNA片段 |
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| ■ 保存 |
| -20℃。 |
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| ■ RNA PCR 的原理 |
| PrimeScript RT-PCR Kit首先用PrimeScript RTase将RNA合成cDNA，再取一部分1st strand cDNA作为模板，由TaKaRa Ex Taq HS进行PCR扩增。将RNA反转录成cDNA的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。 |
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| 图2. PrimeScript RT-PCR Kit原理图 |
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| 图3. PrimeScript RT-PCR Kit 的操作流程 |
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| ■ 特点 |
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RNA模板
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适用于所有RNA |
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扩增片段大小
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～12 kb |
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反转录酶
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PrimeScript RTase (反转录反应最适温度42℃) |
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DNA Polymerase
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TaKaRa Ex Taq HS |
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RNase Inhibitor
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Kit中含有 |
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合成第一条cDNA链的引物
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Random 6 mers、Oligo dT Primer和特异性下游引物 |
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| ■ 反转录反应时Primer的选择 |
| 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。 |
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Random 6 mers
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适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 |
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Oligo dT Primer
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适用于具有PolyA Tail的RNA。(注意：原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA等不具有PolyA Tail)。 |
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特异性下游引物
(PCR时的下游引物)
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必须与模板序列互补，需了解Target序列。 |
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| ■ 使用注意 |
1. 当同时需要进行数次RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。
2. 用PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、TaKaRa Ex Taq HS等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
3. 酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放入-20℃保存。
4. 为了防止Positive Control RNA分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃～-80℃。
5. 分装试剂时务必使用新的枪头，以防止样品间污染。 |
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