Abwiz Bio，我们开发并优化了一个三阶段抗体亲和力成熟平台，该平台涉及三个独立的文库构建和选择/筛选步骤。在每个筛选步骤之后，将工程克隆整合在一起，用于随后的文库构建。在阶段1中使用六个单独的CDR靶向文库可以使我们探索大的序列空间。在每个阶段对工程克隆的筛选和测序，使我们能够监控进度，并提供有用的信息，有助于后续的文库设计。
由于每种抗体的起始亲和力和序列以及抗原的性质对于每个项目都不同，因此很难预先预测亲和力成熟的一阶段是否令人满意，或者是否需要亲和力成熟的第二和第三阶段。因此，在每个阶段的后，我们将介绍已完成的工作并与每个客户进行公开讨论，以确保他们满意并确定项目的后续步骤。
STEAM（增强阶段亲和力成熟度）技术
abwizbio新颖的三阶段工程平台
我们的团队在设计用于基于噬菌体的选择的合成文库方面拥有数十年的集体经验。Abwiz Bio领导了多次成功的亲和力成熟活动，为具有低纳摩尔起始亲和力的人，小鼠和兔抗体产生了> 10倍的亲和力改善。我们已经开发并验证了一种稳健的亲和力成熟方案，该方案始于分别针对六个CDR进行诱变。我们的多阶段方法涵盖了更多的多样性，并产生了更高的亲和力克隆，而这是传统的方法（如CDR步移）无法实现的。
| 阶段1 | 第二阶段 | 第三阶段 |
|---|---|---|
| 6个CDR靶向库 | L1 + L2 + L3和H1 + H2 + H3合并在单独的库中 | 组合式H + L |
| 通过构建针对每个CDR的独立文库，我们对大序列空间进行了采样 | 预先选择的CDR库合并在一起以创建单独的LC / HC库 | 终的文库对预先选择了重库和轻库，以获得高的亲和力克隆 |
依靠经验丰富的团队来设计您的图书馆
抗体的互补决定区（CDR）与抗原形成大部分结合表面。CDR包含三个环，分别从每个抗体臂可变区内的重链（CDR H1，H2和H3）和轻链（CDR L1，L2和L3）延伸。可以通过针对这些区域进行诱变来改善亲和力。但是，噬菌体展示的生物学限制（大大肠杆菌的限制转换效率）将给定库中可能的变体总数限制为〜1E + 10。（与酵母展示相比，库的大小要大得多，大〜1E + 08）。对所有可能的变体随机分配一个6个氨基酸的片段，可产生1.07E + 09的理论多样性；因此，理论多样性可以成倍地超过实际图书馆的多样性。通过靶向单独文库中的每个CDR，可以针对阶段1中的每个单独环优化抗原相互作用。
对于每个CDR，使用生物信息学方法选择假定对于抗原结合而言不是理想的氨基酸。通过将您的序列与抗体种系和结构数据库进行比较，我们可以推断出哪些位置可能已经针对抗原结合进行了优化，哪些可以耐受突变。我们过去在成功开展人类和小鼠治疗候选药物方面的经验，也为我们的选择提供了依据。我们将总文库大小限制在理论多样性极限内，同时避免了会破坏全局抗体稳定性的突变和程度地采样序列图。
抗原结合克隆的CDR H1和H2序列以序列徽标格式显示。值得注意的是，（1）仅在设计用于诱变的每个位置上发现了氨基酸；（2）与阶段1相比，阶段2克隆具有更强的序列收敛性；（3）在亲和力成熟的库中存在高度多样性。
基于噬菌体的选择的好处
噬菌体选择非常灵活，可以调整以获得所需的抗原特异性或亲和力参数。选项包括（1）与阴性对照抗原竞争对交叉反应性结合剂的阴性选择；（2）通过以较低浓度包被抗原和/或通过改变孵育和洗涤时间进行严格选择，以进行基于速率的动力学选择，（3）抗原构象特异性选择与重组和基于细胞的抗原都兼容，后（4）噬菌体病毒在80°C稳定，可以选择热稳定的高表达克隆。
我们专有的载体与Fab噬菌体和可溶性Fab生产均兼容，可在噬菌体淘选后进行快速筛选。选择后，产生数百个随机挑选的克隆，并从细菌上清液中筛选为可溶性Fab。在进入昂贵，费时的IgG生产阶段之前，筛选高通量的潜在候选基因可以节省大量时间和资源。除了全序列分析外，还可以通过ELISA，流式细胞仪，功能分析和SPR高通量筛选针对重组蛋白或基于细胞的蛋白的Fab 。
我们的协议已经过严格验证
我们的三阶段工程策略被用于提高与识别潜在癌症靶标的候选抗体候选物的亲和力。在每个阶段鉴定的工程克隆的测序分析为我们的3阶段策略提供了有力的支持。
筛选过程中鉴定出的*CDR数如下所示。（CDR数）/（CDR总数）显示每个筛选阶段每个CDR的所选克隆的序列多样性。
| 话单 | H1 | H2 | L1 | L2 |
|---|---|---|---|---|
| 阶段1 | 24/24 | 23/24 | 24/24 | 23/24 |
| 第二阶段 | 49/56 | 52/56 | 47/50 | 36/50 |
| 第三阶段 | 74/82 | 44/82 | 76/82 | 64/82 |
在先前的选择回合中识别出的CDR的数量如下所示。这显示了具有先前在阶段1（或阶段1和2）中鉴定的CDR序列的克隆数。
| 话单 | H1 | H2 | L1 | L2 |
|---|---|---|---|---|
| 阶段1 | — | — | — | — |
| 第二阶段 | 0 | 1个 | 0 | 7 |
| 第三阶段 | 0 | 16 | 8 | 18岁 |
在每个阶段的筛选步骤中均一致鉴定出*的CDR序列。传统的CDR步移协议 （在继续设计下一个CDR之前，从单个文库中选择宜CDR克隆），而不是使用我们的方法来组合整个预选CDR库以进行其他文库选择，将无法确定宜方法。候选人。这些数据为我们的三阶段工程策略提供了有力的支持。
展示成功
申请治疗
在一个客户项目中，我们成功地将亲和力提高了10倍，与pM K D的结合力提高了，同时又增加了候选治疗药物的功能。使用了两阶段方法（单个CDR→组合的H + L文库），并且在进一步的临床研究之前就宜工程克隆的序列。
与亲本野生型相比，工程化Fab的解离速率更慢，这表明通过SPR分析提高了亲和力。
提供给客户数十名工程候选人
在另一个客户项目中，我们通过详尽的3阶段方法（单个CDR→单独的H + L→组合的H + L库）将亲和力提高了10-100倍。我们向客户提供了23个经过工程设计的候选物用于IgG功能筛选，每个候选物具有*的序列并大大提高了亲和力。
上面显示了在每个工程阶段之后进行的Fab筛选的克隆。第1阶段克隆显示出比野生型更高的亲和力，但仍保留更快的解离速率。从第2阶段库获得较低的失效率。只有在第3阶段工程后才能获得具有饱和结合和非常慢的脱模速率的克隆。
我们灵活的平台可满足您的需求
仅在第1阶段工程（单个CDR库）或第2阶段（仅重链或轻链库）后，才能确定亲和力的充分提高。在一个项目中，我们的客户对第2阶段后的结果感到满意。我们的灵活平台包括每个工程阶段之后的Fab特性鉴定，从而使我们的客户可以通过在多个点评估项目成果来节省时间和资源。这使我们能够快速提供结果，并根据需要调整我们的工程方法。
测试了阶段2克隆针对亲本野生型Fab和非速率ELISA中宜阶段1工程改造的克隆。选自第2阶段文库的突变可显着改善亲和力。
项目时间表
| 脚步 | 时间 | |
|---|---|---|
| 图书馆建设 | 4-6周 | |
| •基因/寡核苷酸合成 •图书馆合成 •试点研究 |
2-3周 2-3周 1周（并行） |
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| 平移/筛选 | 2-3周 | |
| •噬菌体淘选 •Fab筛选 •序列分析 |
1周 3-5天 2天 |
|
| 一阶段完成 | 基因合成后约2个月 | |
| 2/3阶段 | 由第1阶段的结果告知 | 4-6周 |
我们开始设计您的文库所需要的只是抗体的氨基酸序列。一步，合成用于文库构建的抗体基因和寡核苷酸，通常在基因合成后约2个月完成阶段1工程。第2阶段和第3阶段分别可以在4-6周内完成，因为它们可以立即进行库合成步骤。因为每个项目都是*的，所以我们在每个阶段的开始都与每个客户紧密合作，以仔细审查先前的筛选数据并制定可靠的计划。