百日咳毒素（pertussis toxin）诱导不同动物多发性硬化模型的比较
作者：陆正齐， 朱灿胜， 郑雪平， 王敦敬， 胡学强 作者单位：中山大学附属第三医院神经病学科， 广东 广州
【摘要】 【目的】 研究不同抗原和不同动物的多发性硬化动物模型的神经功能损害和病理特点。【方法】分别用MOG 35-55免疫C57BL/6小鼠建立小鼠EAE模型，以豚鼠脊髓匀浆为抗原致敏DA大鼠建立大鼠EAE模型，用同源猴脑白质匀浆免疫食蟹猴建立非人灵长类EAE模型;分别用不同的神经功能评分标准评价EAE的神经功能缺失，用HE染色观察炎症细胞浸润，砂罗铬花青法（solochrome cyanin）或LBF染色观察髓鞘脱失情况，用改良的Bielschowsky法染色观察轴突损伤;用透射电镜观察超微结构改变。 【结果】 用不同的抗原如MOG 35-55乳化液、豚鼠脊髓匀浆和同源猴脑白质匀浆均能成功制作EAE模型，发病率为100%，其中豚鼠脊髓匀浆诱导的DA大鼠EAE动物模型为急性模型，病情恢复快，炎症反应重，脱髓鞘轻微;用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型为慢性进展模型，炎症反应轻，脱髓鞘和轴突损伤明显，是MS的模型。用同源猴脑白质匀浆致敏的EAE食蟹猴有急性病程的，有复发的，有慢性进展型的，脱髓鞘和轴突变性明显。 【结论】 不同抗原和不同动物的EAE模型无论从病程、神经功能评分和病理改变方面均有自己的特点。用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型是MS的模型。
【关键词】 多发性硬化; 实验性变态反应性脑脊髓炎; 动物模型
Comparison of Various Animal Models of Multiple Sclerosis Induced by Different Antigens on Different Animals
LU Zheng-qi， ZHU Can-sheng， ZHENG Xue-ping， WANG Dun-jing， HU Xue-qiang
（ Department of Neurology， The Third Affiliated Hospital of SUN Yat-sen University， Guangzhou 510630， China ）
Abstract： 【Objective】 To compare neurofunctional impairment and pathological features of various animal models of multiple sclerosis （MS）-experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE）-induced by different antigens on different animals. 【Methods】 C57BL/6 mice EAE model， DA rat EAE model and cynomolgus monkeys EAE model were induced by MOG 35-55 peptide， guinea pig spinal cord homogenate （GPSCH） and cerebral white matter homogenate （CWMH） emulsified with complete Freund′s adjuvant （CFA）， respectively. Neurofunctional scores were recorded. Tissues were sectioned and stained with hematoxylin and eosin （HE） for revealing inflammatory infiltrates. Solochrome cyanin technique or Luxol fast blue staining was used for myelin staining， and Bielschowsky′s staining for axonal damage. Ultrastructure was observed by electronic microscope. 【Results】 EAE models were successfully induced by all methods mentioned above. The morbidity of all the experimental animals was 100%. However， C57BL/6 mice EAE model immunized with MOG 35-55 peptide was chronic and progressive， with mild inflammation， obvious demyelination and axonal loss. DA rat EAE model was acute， with severe inflammation and mild demyelination. Cynomolgus monkeys EAE model was versatile， with acute， chronic relapsing and progressive course and the inflammatory infiltration and demyelination of brain was obvious. 【Conclusion】 These data may indicate that neurofunctional scores and pathological features could be distinctive of various EAE models induced by different antigens on different animals. C57BL/6 mice EAE model immunized by MOG 35-55 peptide emulsified with CFA could be an ideal model of MS.
Key words： multiple sclerosis; experimental autoimmune encephalomyelitis; animal model
[J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2008，29（6）：684-689]
实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是由同种型、同种异型、异种异型致脑炎抗原诱导的、实验敏感动物产生的、由细胞免疫反应介导的、以CNS白质脱髓鞘为特征的迟发性变态反应性自身免疫疾病[1]。根据致敏原的组成、致敏的方法和动物的遗传背景的不同，可诱导出超急性、急性、慢性临床和病理特点的EAE。其中慢性复发性EAE与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）极相似，是MS的模型。可是，我国目前许多学者诱发的模型死亡率高，发病率低，炎症反应重，而脱随鞘不明显，不能代表临床上的MS。我课题组15年来一直从事EAE的制作和研究，下面介绍我科用不同抗原以诱导及不同动物EAE的病情和病理特点。
1 材料与方法
1.1 用MOG 35-55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型
1.1.1 实验材料 C57BL/6小鼠，雌性6 ～ 8周C57BL/6小鼠14只，体质量16 ～ 20 g。动物来源于中山大学动物实验中心。MOG 35-55购于加拿大Sheldon 生物技术中心。百日咳毒素购于上海金畔生物科技有限公司
1.1.2 C57BL/6小鼠EAE模型建立 EAE模型建立参照Zappia等[2]报道的方法。简述如下：所有动物两侧腹股沟上方皮下注射0.1 mL的MOG 35-55乳化液，其中MOG 35-55 100 μg，*Freund′佐剂（CFA）500 μL，其中含500 μg灭活的分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis），每只动物在免疫的当天和48 h后腹腔注射400 ng的百日咳毒素（pertussis toxin） 。
1.1.3 C57BL/6小鼠EAE病情评分 C57BL/6小鼠EAE病情评分标准采用Pluchino等[3]报道的方法，标准如下：1级，部分尾巴下垂; 2级，*尾巴下垂; 3级，*尾巴下垂和站立行走缓慢; 4级，后肢部分瘫痪; 5级，后肢*瘫痪; 6 级，濒死状态。
1.1.4 病理检查 于发病后10 d取3只动物，先用40 g/L的多聚甲醛心内灌注，快速处死，取脊髓的腰骶段，再用多聚甲醛后固定，切成石蜡切片，切片厚度5 ～ 6 μm，4 ℃保存。HE染色[4]：用以观察炎症变化，评分标准[2]：0分，没有炎性细胞;1分，少数散在的炎性细胞;2分，炎性细胞聚集浸润在血管的周围;3分，广泛的血管套形成，并延伸入邻近实质区域，或实质区域的浸润而无明显的血管套形成。砂罗铬花青法[4]（solochrome cyanin）：用来观察髓鞘脱失情况，评分标准如下[2]：1分，软脊膜下少量脱髓鞘改变; 2分，软脊膜下和血管周明显的脱髓鞘;3分，软脊膜下或血管周围脱髓鞘斑块融合; 4分，软脊膜下和血管周围广泛的脱髓鞘累及一半的脊髓，并伴有CNS实质内炎性细胞的浸润; 5分，广泛的软脊膜下和血管周脱髓鞘累及整个脊髓横断面，伴有CNS实质内的炎细胞浸润。轴突染色：用改良的Bielschowsky法[4]染色观察轴突变性。
1.2 用豚鼠脊髓匀浆为抗原致敏DA大鼠EAE动物模型
1.2.1 实验动物 Dark Agouti（DA）大鼠，雌性8 ～ 10周，10只，体质量250 ～ 300 g。动物来源于中山大学动物实验中心。
1.2.2 抗原佐剂乳化物的制备 以豚鼠脊髓匀浆（Guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH）与弗氏*佐剂（complete Freund adjuvant，CFA）均匀混合作为抗原佐剂乳化物。豚鼠以戊巴比妥钠麻醉后（50 mg/kg，腹腔注射），以预冷的冰生理盐水心脏灌注至右心房流出液清亮时，小心取出豚鼠脊髓，挑去脊膜及血管，称质量，加等量的*弗氏佐剂（CFA），用注射器反复抽打，制成油包水状态，即成抗原佐剂乳化物。
1.2.3 DA大鼠EAE动物模型建立 DA大鼠尾根部皮肤常规消毒后，进行单点皮下注射抗原佐剂乳化物0.2 mL。正常对照组动物注射同等剂量CFA + 生理盐水。免疫当日及免疫后所有动物每日观察大鼠饮食、活动情况，并称量体质量。
1.2.4 DA大鼠EAE动物模型神经功能评分 评分标准采用Reynolds等[5]报道的方法，标准如下：0分，无明显异常;1分，尾巴无力松弛;2分，行动迟缓，轻度共济失调;3分，后肢无力;4分，后肢麻痹;5分，四肢麻痹或死亡。
1.2.5 病理检查 于发病后10 d取5只动物，先用40 g/L的多聚甲醛心内灌注，快速处死，取脑和脊髓，再固定，切成石蜡切片，切片厚度5 ～ 6 μm，4℃保存。HE染色：同前。LBF髓鞘染色： Luxol fast blue（LBF） 染色[5]观察髓鞘脱失情况。
1.3 用同源猴脑白质匀浆制作食蟹猴EAE模型
1.3.1 实验动物 食蟹猴，雌性6 ～ 10月，10只，体质量2.5 ～ 3.0 kg。动物来源于广东省灵长类动物实验中心。
1.3.2 抗原佐剂乳化物的制备 健康食蟹猴脑，新鲜无菌保存于零下70 ℃度，在18 ℃下去灰质，按体质量/体积 = 1/1.5将猴脑白质加PBS，制成猴脑白质匀浆，按体积/体积 = 1/1加CFA，用注射器反复抽打，制成油包水状态，即成抗原佐剂乳化物。
1.3.3 食蟹猴EAE动物模型的建立 致敏实验动物产生EAE的途径有皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉注射多种途径，经大量动物试验研究证实皮下多部位注射致敏原诱导EAE的发生率zui高。我们采取腋窝和腹股沟皮下注射免疫动物每处注射0.2 mL，每次3 ～ 4处。5～7 d后重复注射一次。
1.3.4 EAE的病情分级标准 猴EAE的临床病情分级标准参照Massacesi 等[7]报告的猴EAE临床病情评分方法，分为6级：0级，正常;1级，嗜睡、厌食及体质量下降;2级，共济失调、震颤;3级，视力下降、偏瘫及截瘫;4级，四肢瘫;5级，濒死状态。
1.3.5 EAE的病理检查 我们对发病后10 d的EAE猴进行尸解。取猴脑和脊髓，一侧脑-70 ℃保存，一侧用40 mL/L的甲醛溶液固定6 h， 流水冲洗后，从矢状窦将脑切成两半，然后按冠状面分别将额、颞、顶、枕、小脑、脑干、脊髓切成0.5 cm 厚的组织块，按常规方法脱水、透明、浸润、包埋、制成蜡块。染色方法：用HE常规染色[4]观察炎症变化，用砂罗铬花青染色法观察髓鞘变化。电镜切片制作与观察[8]：迅速将新鲜切取的修整成1 mm × 1 mm × 1 mm大小的组织块置于25 g/L的戊二醛和20 g/L多聚甲醛前固定液中作固定3 h以上，取出后，以后固定1.5 h，梯度酒精脱水，环氧树脂Epon812包埋，AO型超薄切片机切片，醋酸铀及柠檬酸铅双染，zui后用日立H-600透射电镜观察。
2 结 果
2.1 C57BL/6小鼠EAE病情变化
所有动物100%发病（14/14），平均发病时间（14.3 ± 1.5） d， 平均病情评分（2.6 ± 0.8）分，zui大病情评分（3.9 ± 1.5）分，病情恢复较慢，为慢性进展的EAE模型（图1）。
2.2 DA大鼠EAE动物模型的病情变化
大鼠注射抗原后14 d精神萎靡、活动减少、食欲减退、体质量逐渐下降。起病的开始症状为尾部张力下降，继而尾部张力消失、单侧后肢及双侧后肢无力、瘫痪，人为翻身后不能恢复姿态，严重者四肢瘫痪，截至观察日期结束未出现死亡。实验组大鼠于免疫后第16天左右开始发病，潜伏期（14.9 ± 0.9）d。表现为一次性急性发病过程，发病率为100%，平均发病时间为10 d，发病的高峰期为注射抗原后18 ～ 22 d，病情恢复较快，平均临床评分为3.4 ± 1.1。
2.3 食蟹猴EAE模型病情变化
经临床病情观察、MRI和CSF 细胞检查发现，本试验用同种型猴脑白质匀浆致敏12只食蟹猴，全部动物于致敏5 ～ 30 d发病，主要表现为：精神萎靡，嗜睡，少食，体重下降，脱毛，共济失调、肢体瘫痪。所有实验动物均发病，病情轻重不同，临床评分2.5 ± 1.2，无一例昏迷或死亡。发病后2月内12只致敏的食蟹猴有3只复发，6只为急性发作型EAE，3只为慢性进展型EAE。
2.4 C57BL/6小鼠EAE病理特点
脊髓HE染色结果发现脊髓的炎症细胞浸润严重，而且多数腰骶段zui重（图2A），有血管套形成（图2B），胸段次之，颈部较轻。脑部炎症相对很轻，而且以脑室周围为主。炎症评分为2.0 ± 0.9。EAE组的脱髓鞘改变与炎症细胞浸润伴行，多数也以腰骶段zui重（图2C），胸段次之，颈部较轻，脑部很轻，脱髓鞘评分为4.0 ± 0.9。轴突染色结果显示，脱髓鞘病变严重的，轴突损伤也非常严重（图2D），两者也几乎并行。
2.5 DA大鼠EAE动物模型的病理结果
2.5.1 HE染色结果 HE染色在光镜下可见发病的DA大鼠的脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润（图3A，B），播及小脑、脑干、脑膜下、血管间隙，小血管周围炎症细胞积聚，呈现袖套样改变（图4A，B），脊髓病变以腰膨大处zui明显。病变早期有少量炎性细胞浸润，随病情发展，病变范围扩大，病灶增多，在病变高峰期血管周围有大量炎性细胞浸润，血管套征增多，病变多位于白质区域内。病理变化与临床病情严重程度基本一致。炎症评分为3.5 ± 0.8。
2.5.2 LBF染色结果 髓鞘染色在光镜下见EAE动物的髓鞘脱失轻微，染色淡（如图5B）。脱髓鞘评分为2.0 ± 0.4。
2.6 食蟹猴EAE动物模型的病理结果
2.6.1 光镜所见 HE染色：见急性EAE额、颞、顶、脑干、小脑和脊髓小静脉周围大量淋巴、单核细胞浸润，格子细胞形成及小胶质细胞呈袖套状浸润（图6A），炎症评分为3.0 ± 0.8。髓鞘染色：见明显的脱髓鞘病灶，分布在小静脉周围（图6B），脑干、小脑及视神经未见脱髓鞘病灶，脊髓颈7，胸1后索见小灶性脱髓鞘病灶。脱髓鞘评分为2.0 ± 0.8。
2.6.2 电镜所见 急性EAE颞叶深部白质，小脑，桥脑可见到正常的髓鞘内少突胶质细胞（ODC）胞浆已明显水肿。髓鞘内板层松解和轴突髓鞘分离，而此时髓鞘外板层正常（图6C，左侧），髓鞘内轴突完好（图6C，右侧，粗箭头），但ODC内水肿明显（图6C，右侧，细箭头），线粒体肿胀，嵴模糊或断裂，核部分溶解。有些髓鞘均匀一致肿胀松解（图6D，左侧，细箭头）。慢性EAE基底节区，小脑及桥脑白质内可见明显的髓鞘脱失或脱落倾向，轴突明显减少，脱髓鞘的轴突变性（图6D，右侧，粗箭头）。
3 讨 论
3.1 不同抗原的EAE特点
髓鞘碱性蛋白（MBP）诱发的EAE模型没有复发缓解的病程，只有炎症反应明显，脱髓鞘轻微，目前认为是急性播散性脑脊髓炎的模型[9]。近来发现，CNS中十分微量的一种糖蛋白M2是导致EAE中脱髓鞘的关键成分，后来证明它是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。已经发现针对MOG的抗体能够在体内和体外造成脱髓鞘，而同时给予抗MOG抗体就能够造成进展性EAE模型[10]。除了在大鼠可造成复发型EAE，单剂注射35 ～ 55肽段MOG在小鼠也可诱发复发—缓解型MS，而在H-2b小鼠诱发慢性进展的MS[11]。它们与MBP诱发的EAE不同，但是更具有MS的特点。
本文用MOG 35 ～ 55诱导C57BL/6小鼠EAE，所有动物100%发病，平均发病时间（14.3 ± 1.5） d， 平均病情评分：（2.6 ± 0.8）分，zui大病情评分（3.9 ± 1.5）分，病情恢复较慢，炎症反应轻，脱髓鞘明显，我们认为是MS的模型。用豚鼠脊髓匀浆为抗原致敏的DA大鼠EAE所有动物14天左右100%发病，平均发病天数为10 d，发病的高峰期为注射抗原后18 ～ 22 d，病情恢复较快，炎症反应重，脱髓鞘轻微，为急性发病过程。而用同源猴脑白质匀浆制作食蟹猴EAE模型12只，全部动物于致敏5 ～ 30 d发病，发病后2月内12只致敏的食蟹猴有3只复发，6只为急性发作型EAE，3只为慢性进展型EAE。因此，用同源猴脑白质匀浆不能诱发的MS模型。
3.2 不同动物的EAE模型特点
EAE的建立不仅与致脑炎抗原和致敏方法有关，而且与动物的遗传背景有关。经免疫遗传学研究发现EAE的发生是由遗传控制的[12]。EAE的易感性受免疫反应基因（Ir基因）影响，Ir基因的调节作用主要表现为T细胞表面受体对MBP产生特异性免疫反应。此特异性表达的受体能与MBP的特异性致脑炎抗原决定簇连接，促使脑炎发生。动物的种类不同，其受体的表达能力不同，从而对EAE的易感性也不同。经研究证实Lewis鼠、SJL/J鼠、猴是zui合适的研究对象。
3.2.1 鼠 不同种类鼠对EAE的易感性不同，Lewis鼠对EAE非常敏感，SJL/J、SWR/J种和中国的KM鼠对EAE也很敏感，而Bow-Norway、Balb/c种鼠对EAE有高度的抵抗性，研究证实后两种鼠T细胞上缺乏对MBP反应的受体[1]。
用鼠作为研究对象的优点是：其遗传基础研究得相当清楚、应用试剂容易得到、繁殖快、价格低廉、诱导EAE发生率高达约80%、复发率高，故适合大规模研究;并且鼠EAE无论在临床、病理和免疫生化改变等方面与人类脱髓鞘疾病较为相似[1]。但是，鼠EAE也有不少缺点：临床症状不易观察;辅助检查不易进行;抽血检查外周血T淋巴细胞会影响EAE的发展;影像学研究受到影响，尤其是与人种属差异大。
3.2.2 猴 不同种属的猴对EAE的敏感性不同，其中恒河猴、食蟹猴、Callithrix Jacchus 猴对EAE非常敏感，目前国外应用较多。另外，研究发现MHC-DPB1等位基因是猴对EAE敏感的主要遗传因素[12]。
恒河猴和食蟹猴的应用zui多，因为：诱发EAE发生率高，达90%以上，复发率也高;症状出现早，一般在致敏后6 ～ 12 d;症状极易观察评价;辅助检查和抽血检查易进行且不影响EAE的发展;其临床、病理、生化与免疫学改变与人类CNS脱髓鞘疾病极其相似;影像学研究不受影响，而且与人种属差异小，药物试验性治疗代表性大，因而其应用价值大，为研究人类MS提供了重要模型。近年来，Genain 等[13]认为非人灵长类动物和人的免疫系统基因具有相似性，非人灵长类EAE动物模型为MS的研究提供了非常重要的理论依据，特别在MS的影像学和探讨新的治疗措施方面。另外，Genain[14]用Callithrix Jacchus 猴用髓鞘加CFA免疫形成RR-EAE。他们认为这种EAE的病理与MS的脱髓鞘斑块非常相似。而且认为自身抗体主要攻击的靶是MBP和MOG，另外他们也认为这种猴的EAE可以使得EAE的MRI 研究成为可能，而且这种模型的研究可以加快MS的治疗进展。
我们用SJL/J小鼠、DA大鼠和食蟹猴成功制作了EAE模型。因国外有报道[15]不同抗原在同一种动物身上不能诱发发病率高的EAE模型，因此，我们没有做不同抗原在同一种动物身上的诱发试验。我们认为豚鼠脊髓匀浆诱导的DA大鼠EAE动物模型为急性模型，病情恢复快，炎症反应重，脱髓鞘轻微，是急性播散性脑脊髓炎的模型;用MOG 35 ～ 55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型为慢性进展的模型，炎症反应轻，脱髓鞘和轴突损伤明显，是MS的模型。用同源猴脑白质匀浆致敏的EAE食蟹猴有急性病程的，有复发的，有慢性进展型的，非常类似多发性硬化。但猴价格昂贵，繁殖慢，数量相对较少，而且检查的试剂不容易得到，不适合大规模实验研究，适合影像学和治疗的研究。
总之，不同抗原和不同动物的多发性硬化动物模型无论从病程、神经功能评分和病理改变方面均有自己的特点。用MOG 35 ～ 55乳化液制作C57BL/6小鼠EAE模型是MS的模型。
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