上海金畔生物科技有限公司提供彩色质粒小量提取试剂盒(柱式) ,欢迎访问官网了解更多产品信息。
产品编号 |
C6201 |
英文名称 |
Plasmid Extraction Mini Kit |
中文名称 |
彩色质粒小量提取试剂盒(柱式) |
别 名 |
Plasmid Extraction Mini Kit(with column); 多彩质粒小提; |
保存条件 |
室温干燥可保存一年,4℃保存可更长时间。 |
注意事项 |
This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications. |
产品介绍 |
产品简介 本试剂盒利用多彩的颜色变化,监控质粒提取的每步过程,让实验变得高效并轻松有趣。本试剂盒用于高纯度质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理,质粒可从菌体中释放出来,并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质,在低盐、高 pH 条件下洗脱,最后得到高达 20 ug 纯度较高的质粒 DNA。使用本试剂盒每次可处理 1 -5 ml 过夜培养的菌液,可在 30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序等各种分子生物学实验。
产品优势 1. 操作简易、快捷、高效(得率高)。 2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净。 3. 含有指示剂,可直观判断操作过程中样本裂解程度。 注意事项 1. 细菌培养时间一般为15小时左右,如接种量大则应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒 DNA 突变。 2. 使用前应将全部RNase A溶液加到Solution I中混合均匀,2-8℃可稳定保存6个月;若溶液II、III 产生沉淀,应在使用前置于37℃下溶解沉淀;同时并注意溶液 I,II 和 III 的用量比例,若细菌量增大,需按比例放大这些溶液的使用量。 3. 随菌体增多应延长 Solution II 的作用时间,直至溶液成粘稠透明状,但时间过长会导致质粒 DNA 变性。 4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。 5. 纯化的质粒在电泳中表现为2-3条带有时甚至为4-6条带均属正常,未分开的环套质粒,易被误判为基因组 DNA。
操作步骤 1. 柱平衡:向离心吸附柱中加入 400 μl Buffer BL,静止 1 min,室温下 12,000 rpm 离心 1 min,弃除收集管中的废液,将离心吸 附柱重新放回收集管中。注意:请使用当天处理过的吸附柱。 2. 取 1-5 ml(如果是低拷贝质粒可以收集更多菌液)过夜培养的菌液,室温 12,000 rpm 离心 1 min,尽量将上清去除干净。注意:根据菌液的浓度决定取液量,浓度高时取 1.5 ml 菌液离心即可,浓度低时可多收集一次。 3. 加入 250 ul Solution I,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀,呈现出均匀浑浊的棕红色。注意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低。 4. 加入 250 ul Solution II,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠的紫红色。注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 片段的污染,所用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能是菌体太多,可增加 Solution II的用量,在后续的操作中 Solution III的用量也要相应增加。 5. 加入 350 ul Solution III,立即温和颠倒混匀,可见红黄相间的沉淀物产生,继续混匀直到完全变为黄色,室温静置 2 min,然后 12,000 rpm 离心 5 min。注意:Solution III 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中还有紫色漂浮物,说明复性不充分,继续混匀至溶液颜色完 全变为澄清的黄色。 6. 小心将上清液转移到离心吸附柱中,静置 2 min,让质粒 DNA 与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。 7. 可选步骤:向吸附柱中加入 500 ul Buffer WB1,12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。注意:如果宿主菌是 endA-,如 DH5α 或 TOP10,此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+,如 TG1、BL21、HB101、JM101 等,此步骤不可省略,因这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤。 8. 加入 500 ul Buffer WB2,室温 12,000 rpm 离心 30 sec,弃收集管中滤液。注意:Buffer WB 2 为浓缩液,初次使用按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发。 9. 重复步骤 8 一次。 10. 室温 12,000 rpm 离心 2 min,甩干残留液体。注意:此步不能省略,否则残留乙醇会影响质粒的后续使用。 11. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 ml 塑料离心管(自备)中,加入 50 ~ 100 ul 的洗脱液 Buffer EB,室温放置 2 min。12,000 rpm 离心 1 min,离心管底溶液即质粒 DNA。注意:为增加洗脱效率,可将洗脱液在 60℃预热。如需使用去离子水洗脱,可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 – 8.5 之间,为了增加质粒回收率,可将得到的溶液重新加入到离心管中,室温放置 2 min,再次离心收集。
低拷贝或大质粒(>10 kb)提取 如果所提质粒为低拷贝质粒,或大于 10 kb 的大质粒,或提取农杆菌质粒,或提取革兰氏阳性菌质粒,应加大菌体使用量,使用 5-10 ml 过夜培养物,同时按照比例增加 Solution I、II、III 的用量,洗脱液 Buffer EB 应在 60℃水浴预热,在吸附和洗脱时可以适当延 长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。
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