Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品
Santa Cruz生物技术公司为*抗体提供了高品质的支持产品。包括用于WB和IHC的自产的第二抗体, 用于IP研究的发光试剂,琼脂糖标记proteinA,proteinG PLUS和proteinL,用于WB的胞核提取,全细胞溶解物,组织提取试剂,WB膜,TransCruz凝胶迁移寡核苷酸,封闭物和实验室常用试剂。 提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量标准和预染分子量标准。ImmunoCruz染色系统用于IHC(石蜡切片)染色,为预稀释,即用系统。还介绍一系列凋亡检测试剂 盒。支持产品主要涵盖以下方面:1)WB 2)IP 3)IP/WB 4)免疫复合蛋白激酶检测 5)免疫过氧化物酶细胞染色 6)免疫荧光细胞染色 7)流式细胞技术(FCM)8)ELISA检测 9)TransCruz凝胶超迁移实验 10)用多肽中和抗体活性的方法 11)染色质免疫沉淀(ChIP)实验 12)siRNA转染 13)半定量RT-PCR 14)溶液配制。
1. WB
A.样品准备
注意:细胞培养基产品包括经典和特殊培养基,血清,培养基添加物,诱导物,抗生素。产品列表请登陆www.scbt.com。
单层细胞
室温下,移去培养基并用PBS冲洗直径100mm的培养皿。以下步骤均在冰上或4℃操作,使用冰预冷的新鲜缓冲液。
加入0.6ml RIPA裂解液(sc-24948)。4℃轻轻晃动细胞培养皿15min。用细胞刮将贴壁细胞刮下。转移裂解液至微量离心管内。
用0.3ml RIPA裂解液洗一次培养皿,将洗液与之前的溶解物合并。(可选择:加入10μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液和/或用21号注射器针头切割DNA)冰上孵育30-60min。
将细胞溶解物4℃离心,10000×g,10min。转移汉细胞裂解物的上清至新的离心管内,弃沉淀。
注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。
悬浮细胞
室温低速离心5min,收集约2.0×107个细胞。小心除去培养基。
室温下用PBS冲洗细胞沉淀,再次低速离心5min,小心除去培养基。
加入1.0ml冰预冷的RIPA裂解液(sc-24948),裂解液中现用现加入蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂。用移液器轻轻悬浮细胞,冰上孵育30min。
用21号注射器针头、杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化。注意不要使裂解物温度过高。(可选择:加入10μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液。)冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管,4℃离心,10000×g,10min。转移上清至新的离心管内,弃去沉淀。
注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。
组织样品
称重组织块,并用干净的剃刀剪碎。冰冻组织可被切的很薄,并在含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(sc-24948)中解冻。3ml冰预冷的RIPA/g组织。
杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化,温度维持在4℃。(可选择:加入30μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液/g组织。)冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管,4℃离心,10000×g,10min。弃沉淀。可加长离心时间获得更好的裂解产物。
注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。
B电泳
将样品(每个泳道全细胞提取物40-60μg,胞核提取物10-20μg或10-20ng纯化蛋白)与等体积2×电泳上样缓冲液(sc-24945)混合,煮沸2-3min。未用完的样品可保存在-20℃。
上样,10μl/1.0mm×0.75mm孔。
推荐使用Cruz MarkerTM分子量标准(sc-2035)。小胶(0.75mm)每孔上样2μl,大胶(1.5mm)每孔上样5μl。如用与Cruz MarkerTM一致的第二抗体,可看到用于检测试剂的内参条带。也可选择预染分子量标准(sc-2361)。
电泳步骤参考标准protocols。
根据厂家protocols,用电转装置将蛋白条带转移至NC膜或PVDF膜上。
注意:Cruz Blot SystemTM提供预制好的人或小鼠全细胞提取物和核提取物,或小鼠组织提取物。
C.Immunoblotting
用Blotto(BlottoA或B;用抗牛第二抗体时建议使用BSA)封闭膜上的非特异位点,室温孵育30-60min。也可选择用不含Tween-20的Blotto,在封闭容器内4℃过夜孵育。
如果使用的是磷酸化特异抗体,建议向封闭液和抗体稀释液中加入50 mM NaF(NaF:sc-24988)抑制磷酸化酶。
封闭好的膜与*抗体(Blotto稀释)稀释液室温孵育1小时。(如果是磷酸化特异抗体,要用加了50 mM NaF的Blotto稀释液。)抗体*浓度根据滴度决定。建议起始稀释度为0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次,5min/次。
将 膜与HRP或AP标记的第二抗体稀释液(Blotto稀释)室温孵育45min,稀释度1:500-1:2000。如果背景过高,第二抗体需进一步稀释 (可达1:20000)。作ECL时,如果使用Cruz MarkerTM分子量标准(sc-2035),必须使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作为可视化标准。
TBST洗膜3次,5min/次,然后TBS洗膜一次,5min。
将膜与化学发光试剂(sc-2408)孵育。如果发光化合物用于可见光检测,必须用HRP标记的第二抗体。
2.IP
注意:本操作步骤可用于放射性或正磷酸盐标记的细胞。(放射性物质的使用及处理应遵循适当的条例如OSHA和 NRC指导手册。)细胞标记必须在无待标记氨基酸残基或无磷酸盐的培养基中进行。建议标记前使细胞处于适当的饥饿状态。孵育培养细胞(100mm细胞培养 皿上约80-90%
单层细胞汇合或培养瓶内含约2-5×107个悬浮细胞)。通常,用传代贴壁细胞或2-5×107个悬浮细胞可得到*标记。
例如:除去培养基,加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的无蛋氨酸培养基。37℃孵育1h。某些蛋白需延长标记时间(18hrs)。有必要用PBS洗涤细胞除去未结合的放射物。
向单层传代细胞中加入1-3ml冰预冷的RIPA(sc-24948),4℃孵育10min。对于悬浮细胞则向离心管中加入RIPA洗涤细胞沉淀。
用21号注射器针头或超声波反复裂解细胞。转移裂解物至微量离心管中。
可选择:用1.0ml冰预冷的RIPA冲洗细胞培养皿,与之前的合并处理。
4℃,10000×g离心10min。冰上转移上清(细胞溶解液)至新的微量离心管。
预处理细胞溶解液,加入1.0μg的control IgG(与*抗体的种属来源一致)和20μl悬浮的(25%v/v)琼脂糖偶联物(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。4℃孵育30min。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s。
转移上清或约100-1000μg总细胞蛋白至微量离心管中。加入1-10μl(如0.2-2μg)*抗体(抗体浓度应滴定测定),4℃孵育1-2hrs。或者,可加入20μl*抗体琼脂糖偶联物,混匀,4℃孵育1hr-过夜;跳过下一步骤。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好管子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s,收集免疫沉淀物,小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次,每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后,小心吸弃上清,用40μl 2×电泳上样缓冲液(sc-24945)重悬沉淀。
样品煮沸2-3min,上样电泳分离免疫复合物,通过放射自显影观察结果。未用完的样品可保存在-20℃。
可选择:煮沸后,样品可经离心沉淀琼脂糖颗粒,然后SDS-PAGE分析上清。
3.IP/WB
按照之前描述的WB程序准备总细胞溶解物。
注意:如进行磷酸化研究,溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集磷酸化蛋白。
预处理全细胞溶解物(可选择步骤),约1ml全细胞溶解物或组织提取物,加入0.25μg适当的control IgG(与*抗体种属来源一致)和20μl悬浮的(25%v/v)琼脂糖偶联物(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂 糖)。4℃孵育30min。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s。转移上清(细胞溶解物)至干净的微量离心管。
1ml细胞溶解物或约100-1000μg总细胞蛋白,加入10μl*抗体琼脂糖偶联物,混匀,4℃孵育1hr-过夜。
可 选择:如无*抗体琼脂糖偶联物,1ml细胞溶解物加入1-10μl(如0.2-2μg)*抗体(抗体浓度应滴定测定),4℃孵育1-2hrs。加入 20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好管子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s,收集免疫沉淀物,小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次,每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后,小心吸弃上清,用40μl 2×电泳上样缓冲液(sc-24945)重悬沉淀。
样品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上样孔上样5-10μl。
电泳并按WB程序作免疫杂交。
注意:选择不同的第二抗体,55kDa重链和27kDa轻链IgG,可检测到*抗体。如果以上步骤中采用*抗体琼脂糖偶联物则*抗体条带不明显。
4.免疫复合蛋白激酶测定
从100mm细胞培养皿(单层细胞80-90%汇合)移除培养基,PBS洗一次。
加入1-3ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液(sc-24948),4℃孵育10min。(注意:RIPA裂解缓冲液对某些激酶效果不好。需要优化裂解液成分来保持激酶活性。)
用21号注射器针头反复抽吸使细胞破碎充分,转移至15ml离心管中。
用1ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液,0.5%Triton X-100(sc-29112)冲洗培养皿,与原裂解液合并。
10000×g,4℃离心10min。4℃转移上清至新的离心管内。
转移1.0ml细胞提取物(上清)至1.5ml离心管中。加入1-10μl(0.2-2μg)*抗体(抗体*浓度经滴定测定),4℃孵育1hr。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液((A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好盖子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心5min,收集免疫沉淀复合物。小心吸弃上清。
1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次,每次重复上述离心步骤。
20μl 适当的蛋白激酶缓冲液重悬沉淀(如50mM HEPES(sc-29097),0.1mM EDTA(sc-29092),0.01%BRIJ 35(sc-29087)),0.1mg/ml BSA,0.1% β-巯基乙醇(sc-29086),0.15M NaCl(sc-29108)。缓冲液成分根据所研究的激酶调整。
加入10-1000ng多肽底物。该底物/酶/细胞系的多肽底物浓度应根据经验决定。
准备1ml ATP混合物:930μl适当的蛋白激酶缓冲液,6μl 50mM ATP,pH7.0,20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每个样品加入10μl ATP混合物,30℃孵育30min。冰上放置。
加 入等体积2×电泳上样缓冲液(sc-24945)终止反应,样品煮沸2-3min。样品可离心沉淀琼脂糖微珠(可选择);分析上清。跑SDS-PAGE, 通过放射自显影观察结果。未用完的样品保存在-20℃。检测中如用小肽底物,样品必须通过闪烁计数或其他标准方法而不是SDS-PAGE来分析。
5.免疫过氧化物酶细胞染色
A. 组织培养细胞
在无菌的盖玻片上培养细胞37℃过夜。PBS简单冲洗后按以下程序之一固定细胞:
1)-10℃甲醇溶液5min,自然干燥(推荐方法);或
2)冰丙酮2min,自然干燥;或
3)1%甲醛-PBS 10min(保持湿润)。
PBS洗三次。
可选择:含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次,5min/次。
B.冰冻组织切片
冰冻组织存放于液氮中。切片前(2周)可保存于-70℃。
95%乙醇清洁玻片,涂一薄层黏附剂,自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-10μm。室温贴片。切片保存在-70℃。固定染色前室温解冻切片。
注意:免疫组化切片固定剂清单包括Clarion和Crystal固定剂。
冰丙酮固定切片10min,冷藏。PBS洗三次。
可选择:含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次,5min/次。
注意:组织内有丰富的生物素(引起高背景染色),建议甲醛固定,遵循石蜡包埋组织切片protocol,因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。
C. 甲醛固定,石蜡包埋组织切片
按标准程序甲醛固定,石蜡包埋组织。
95%乙醇清洁玻片,涂一薄层黏附剂,自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-6μm。二甲苯脱蜡,3次,5min/次。依次过梯度酒精水化:100%乙醇,2次,10min/次,95%乙醇,2次,10min/次。去离子水浸洗1min。甩去切片上多余的液体。
可选择:可做抗原修复。甲醛固定和石蜡包埋导致某些抗原决定簇被封闭,可按以下方法修复暴露抗原位点:
i. 热修复(推荐方法):切片浸没入10mM柠檬酸钠缓冲液(sc-29109),pH6.0;或浸没入含0.01% (w/v)EDTA(sc-29092)的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(甘氨酸:sc-29096)中,pH3.5。95℃加热5min。换新的缓冲 液,95℃加热5min。(不同组织类型*孵育时间不同)。将切片放入缓冲液中冷却约20min。用去离子水洗3次,2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶:切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室温孵育10-20min。去离子水冲洗几次,甩去多余液体。
iii. 皂角苷:切片用含0.05%皂角苷的去离子水室温孵育30min。PBS至少洗3次,甩去多余液体。
可选择:切片在含0.1-1%过氧化氢的去离子水中孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性,PBS洗2次,5min/次。
注意:组织内有丰富的生物素(引起高背景染色),建议甲醛固定,遵循石蜡包埋组织切片protocol,因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。
D.免疫过氧化物酶染色
切片的免疫酶染色,建议用Santa Cruz的ABC染色试剂盒或ImmunoCruzTM染色试剂盒。ABC染色试剂盒利用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物作为检测物;而 ImmunoCruzTM染色试剂盒利用链亲和素辣根过氧化物酶复合物作为检测物,该体系包括所有预稀释好的第二抗体,即用型,也包括预稀释的*抗体。 所有染色体系中均有完整的protocol;以下为简化版protocol。
所有反应步骤均于室温下湿盒内完成。使用前试剂盒试剂要先恢复至室温。操作中切片不能过干。每步操作完用吸引管吸除试剂,避免切片过干。要用足够的反应液覆盖标本(通常100μl/张切片就足够了)。
ABC染色试剂盒
PBS稀释的1.5%封闭血清孵育1hr。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体室温孵育30min或4℃过夜孵育。抗体*反应浓度需经滴定确定;建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次,5min/次。
滴加预稀释的生物素化第二抗体或用含1.5%封闭血清的PBS稀释至1μg/ml的生物素化第二抗体,孵育30min。PBS洗3次,5min/次。
滴加亲和素生物素酶反应物,孵育30min。PBS洗3次,5min/次。
用提供的过氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出现理想染色止。注意监控单张切片的恰当显色时间。去离子水洗5min。可用苏木素(sc-24973)复染5-10s。迅速用去离子水洗几次。
梯 度酒精,二甲苯依次脱水:浸没入95%乙醇2次,10s/次,然后100%乙醇2次,10s/次,zui后二甲苯3次,10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加 1-2滴封片固定剂(如Clarion,sc-24942),盖上盖玻片(sc-24975),光学显微镜下观察。
ImmunoCruzTM染色试剂盒
滴加1-3滴血清封闭液孵育20min。甩去封闭液。
迅速加入1-3滴预稀释的*抗体。如果所用染色系统不含预稀释的抗体,就把*抗体用血清封闭液稀释至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS冲洗,然后切片浸没入PBS内洗2次,2min/次。甩去多余的液体。
滴加1-3滴生物素化第二抗体,孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP-链亲和素复合物,孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP底物混合物。显色30s-10min,或直至出现理想染色止。去离子水冲洗,然后切片浸没入去离子水内洗2次,2min/次。
复染,脱水,封片。(同ABC染色试剂盒)
6.免疫荧光细胞染色
切片准备同免疫酶染色,省去包括过氧化氢处理细胞在内的zui后一步。
每步操作完吸除反应液,但要避免样品过干。用足够的反应液覆盖样品(100-500μl/张切片)。
滴加含10%封闭血清-PBS,孵育20min,减少和IgG结合的非特异位点。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体,孵育60min。抗体*反应浓度应滴定决定;建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml,PBS洗3次,5min/次。
滴加生物素标记或荧光染料标记的第二抗体(用含1.5%-3%封闭血清的PBS稀释至1-5μg/ml),孵育45min。PBS洗3次。如果使用荧光染料标记的第二抗体,须暗室孵育,并省略下步。
滴加链亲和素-荧光素,暗室孵育15min。链亲和素标记物浓度需经滴定决定;建议PBS稀释至10-20μg/ml。PBS充分洗净。
用水相固定剂或90%甘油PBS溶液封片。
选择适当的滤镜在荧光显微镜下观察。室温避光保存切片(UltraCruzTM固片剂:sc-24941)或保存在4℃(甘油/PBS固片剂)。
7.流式细胞仪技术
细胞表面染色
准备细胞
1) 溶解血红细胞。(注意:准备足够的细胞用于10份样品100μl/份检测)。
1ml全血加入14ml恢复至室温的1×FCM溶解液(sc-3621)中。
轻轻混匀,室温孵育3-5min。不要超过5min。
离心5min,弃上清,预冷的5ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
离心5min,弃上清,预冷的1ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
2)准备培养细胞。(注意:本protocol通常处理50ml培养细胞。单层细胞,切勿胰酶消化!用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗细胞1次。)
血球计数仪计数细胞。
1000rpm离心5min,弃上清,用足够的1×PBS轻轻重悬沉淀至终浓度为1×107细胞/ml。
各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。(20μl/106细胞。滴定抗体确定*浓度)。
每管加入100μl RBC溶解的全血或单细胞悬液。混匀,放在有盖的冰盒内孵育15-30min。
每管加入1.5ml FCM冲洗缓冲液(sc-3624),颠倒混匀。1000rpm离心5min,弃上清,500μl 1%多聚甲醛重悬沉淀。
测读分析数据。
细胞内染色
可用适当的活性物质刺激细胞。确保有未刺激细胞对照。
50ml离心管收集细胞。2000rpm离心5min,弃上清。
室温1×PBS 20ml重悬细胞。
细胞计数。
2000rpm离心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm离心5min除去PBS。
每106个细胞加入1ml 4℃ FCM固定缓冲液(sc-3622),冰育15-30min。
4℃1×PBS洗细胞2次,离心,弃上清。
每106个细胞加入1ml -20℃ FCM渗透缓冲液(sc-3623),逐滴加入混悬。冰育15min。
离心;4℃ FCM冲洗缓冲液(sc-3624)。
2000rpm离心5min,弃上清。每107个细胞加入1ml FCM冲洗缓冲液,然后等分细胞(106)至各待测管中。
细胞内着染:各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。室温避光孵育1hr。
注意:为得到*结果应滴定荧光染料标记抗体。
1ml FCM冲洗缓冲液洗细胞2次, 500μl新鲜FCM冲洗缓冲液重悬。
24hrs内检测分析。
8.ELISA检测
包被微孔板,靶蛋白用50mM碳酸盐包被液(pH9.0)稀释。*包被浓度须经滴定,但纯化抗原通常为1μg/ml,50μl/孔。封好,4℃过夜孵育。
弃净液体。加入200μl/孔封闭液(含1%BSA和0.02%叠氮钠的PBS)封闭非特异结合位点。室温孵育1-2hrs或4℃过夜孵育。
弃净液体。含0.02%叠氮钠的PBS洗1次。湿润的微孔条可用塑料密封袋密封,4℃保存4周。用前,弃净多余的液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的待测样品和对照。抗体需梯度稀释测定滴度或用以前的工作浓度作筛选或半定量。室温孵育1hr。
含0.05%Tween-20(sc-29113)的PBS洗板3次,弃净液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的1:100-1:1000的碱性磷酸酶标记抗体。*抗体浓度需滴定决定。室温孵育1hr。
弃净液体。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次,拍干,弃净液体。
乙醇胺缓冲液(10mM乙醇胺,0.5mM MgCl2(sc-29098),pH9.5)洗1次,弃净液体。
用乙醇胺缓冲液稀释底物(PNPP,sc-3720)至终浓度1mg/ml。加入50μl/孔。反应10-20min直到阳性对照OD405/490读数达1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA,pH7.5终止反应。OD405/490读数。
9、TRANSCRUZTM 超凝胶迁移检测
用多聚核苷酸激酶将[γ32p]-ATP 标记到寡核苷酸上,达到50,000cpm/ng
准备胶迁移缓冲液:10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
准备20ul的反应混合物,将3-10ug核抽提物,和1ug多聚dIdC溶解在20ul胶转移缓冲液中。加0.5ng标记的寡核苷酸探针,室温孵育20分钟。这组成了检测DNA-蛋白复合物的对照样品
为了检测抗体迁移或封闭DNA-蛋白复合物,按步骤3准备反应混合物,每20ul反应体积加1-2ul TransCruzTM 超凝胶迁移抗体。一般是在加了探针之后,才加抗体,但在加探针前加入抗体,可使结果加强
通过4% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(25-30ma),分开DNA和蛋白复合物。凝胶中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待胶干后,自动放射显影查看结果
10、肽的中和
对所有的santa cruz的亲和纯化的兔或山羊的多抗和单抗,都有相应的封闭肽做对照。通过将抗体和封闭肽的预先孵育,抗体对抗原的结合可以被阻止。
决定zui高的抗体稀释度,在这个稀释度下,可以一直获得理想的阳性结果。例如,H-Ras在免疫沉淀时,推荐的浓度是1ug/ml,但阳性结果是在50ng/ml。
封闭/竞争时,将抗体(抗体浓度按照以前提到的方法确定)和5倍重量的封闭肽混合在500ul的PBS中,室温孵育2小时,或4度过夜。
封闭/竞争后,用封闭缓冲液稀释抗体/封闭肽混合物,然后,按照所期望的实验的操作进行。
11,染色质免疫沉淀
注意:CHIP的实验步骤可以有很多不同版本,下面介绍的步骤适合大多数的实验
常温下,用PBS洗细胞,重悬细胞,使细胞数大约5*105个/ml(总细胞数2*107)。,
加甲醛,使终浓度为1%,室温孵育10分钟。
加甘氨酸至终浓度0.125M,终止交联反应
2000rpm,5分钟,离心细胞。用冷的PBS洗细胞一次
用6ml的裂解缓冲液重悬细胞,轻柔混合,2000rpm离心5分钟,收集粗提的核提取物。
再用PBS洗沉淀,沉淀可以冻存,或继续以下步骤。
用1.9ml的高盐裂解缓冲液重悬沉淀,转移到2ml的离心管中准备超声
超声条件需要优化,下面介绍的条件是在使用Sonics VC130和3mm的探头的基础上建立起来的:
在冰上操作,输出功率设置5(R)6,每隔30秒超声一次,共4次。
4°C,10,000rpm 离心15分钟,保存上清,确定上清中蛋白的浓度。
如果免疫沉淀,我们推荐100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz试剂(0.2—2ug)
注意:研究者可能希望使用连接有葡聚糖或磁珠的一抗,以便于选择后续免疫沉淀的试剂。有些情况下,将针对同一种蛋白不同表位的抗体联合使用会更好。
向染色质溶液加50ul Protein A/G-琼脂糖,4度,孵育30分钟,使其澄清,zui大速度,4度离心5分钟。
向上清中加一抗,4度孵育过夜。
加50ul Protein A/G –琼脂糖,4度孵育2小时。
12,000rpm离心20秒收获磁珠,并将管放在冰上
用1ml裂解缓冲液洗磁珠2次
用冲洗缓冲液洗磁珠四次
重悬磁珠在400ul洗脱缓冲液中
通过在67度水浴中孵育管子2小时以上,使反向交叉连接
离心去除磁珠,继续在67度水浴孵育上清过夜 Remove
10,000rpm离心3分钟去除残留的珠子,保留上清
分离DNA,用500ul 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提上清,剧烈振荡,14,000rpm离心3分钟分离两相。
保留水相,用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) 反向抽提有机相一次,在汇集水相
用600ul 氯仿/异戊醇抽提汇集的水相
DNA可以用商业化的试剂盒浓缩。
12. siRNA小干扰RNA
转染
*天:准备细胞
健康的细胞是成功转染的要求,在转染前明确细胞的生存状态
对于贴壁细胞:
1,吸弃培养基,用胰蛋白酶、EDTA、或其他合适的方法分散细胞,在胰蛋白酶化前,用无菌的1X PBS漂洗细胞2次。
2,一旦细胞分散,用4倍体积的含10% 胎牛血清不含抗生素的生长培养基(如DEME,RMPI1640)稀释悬浮液 。
(注意:这个阶段使用不含抗生素的培养基是转染成功的关键)
3,1,000 rpm离心5分钟,去除培养基,用不含抗生素的培养基重悬沉淀
4,转移细胞到12孔的细胞培养板 以便细胞过夜培养后,细胞覆盖率达60-80%
(注意:细胞覆盖率也是成功转染的关键)
对于悬浮细胞:
1,1,000 rpm离心5分钟
2,去除培养基,用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培养基重悬沉淀
3,转移细胞到12孔的细胞培养板或转到多聚赖氨酸包被的8孔板中,以便细胞过夜培养后,细胞覆盖率达60-80%
(注意:多聚赖氨酸包被是使悬浮细胞黏附到板底必须的)
第二天
准备转染试剂和转染
注意:对于不同的实验目的有不同的操作步骤,请根据试验需要选择下面介绍的操作步骤。
对于蛋白和转录检测
注意:当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时,转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1,对每一次转染,在一个无菌的小管里准备下面的混合物 这一步无关细胞培养类型
(A) 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA转染培养基中,轻柔混合,在室温中放置15分钟 (注意:如果需要低浓度的siRNA,用siRNA稀释缓冲液进行稀释)
(B)加2.4ul siRNA转染试剂到40ul的siRNA转染培养基中,轻柔混合,室温放置5分钟。
注意:虽然siRNA转染试剂对许多细胞都有很高的转染效率,但并不是适用于所有的细胞
2, 5分钟后,混合A和B形成siRNA-siRNA转染试剂混合物,轻柔混合,室温孵育20分钟。
3, 然后,向每个含有siRNA-siRNA转染试剂混合物的管中加入0.32ml的siRNA转染培养基,轻柔混合
对贴壁细胞:
4.1转染前,吸弃培养基,用1ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次,弃培养基。
4.2在洗过的细胞上,铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物,37度,5-7小时
4.3孵育后,向含有转染细胞的每个孔中加0.4ml 生长培养基,其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍,无需去除转染混合物。如果,毒性是个问题的话,去除转染混合物,以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
4.4孵育结束后,用新鲜正常生长培养基替换,继续孵育24-72小时
4.5从细胞中吸弃培养基,用1ml 1*PBS洗细胞一次,然后丢弃
4.6放置在冰上,向孔中加入300ul 1*电泳缓冲液,用移液器吹打,混匀。(注意:混合物可能变得粘稠)
如果进行Western blot的话,转移混合物到15ml的锥形管中,放在冰上,对混合物进行超声波降解,每15秒一次,用输出功率的40%。如果,超声后,起很多泡泡,1000转/秒,离心3分钟,然后,按照western blot的方法进行电泳,免疫印迹。
如果做转录分析,按照我们的半定量RT-PCR的操作进行。
对悬浮细胞
4.1在转染前,1000转/秒, 离心5分钟收集细胞。去除培养基,用1ml 无菌的siRNA转染培养基 。
4.2 再次离心1000转/秒,5分钟,去除培养基。用稀释的siRNA-siRNA转染试剂复合物重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板,37°C孵育5-7小时,每次单独转染时重复。
4.3孵育后,加0.4ml含2倍正常血清和抗生物浓度的生长培养基到每个含被转染细胞的孔中,不要去除转染混合物。如果有毒性的话,去除转染混合物,代替以正常生长培养基,在额外孵育18-24小时。
4.4一旦孵育结束,离心细胞,去除培养基。用新鲜的正常生长培养基重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板,继续孵育24-72小时。
如果 需要做western blot分析,则继续以下步骤
转 移混合物到15ml的锥形管中。将2*电泳上样缓冲液用Milli-Q超纯水稀释到1* 。1000转离心5分钟,收集细胞,去除培养基,用1ml PBS洗细胞,重复一次,用300ul 1*电泳上样缓冲液重悬细胞,放在冰上,对混合物进行超声波降解,每15秒一次,用输出功率的40%。如果,超声后,起很多泡泡,1000转/秒,离心3 分钟,然后,按照western blot的方法进行电泳,免疫印迹。
如果需要转录分析,参照半定量RT-PCR步骤。
免疫荧光检测
注意:当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时,转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1,准备以下混合物:
(A)加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA转染培养基中,轻柔混合,在室温放置5分钟 注意:如果需要低浓度的siRNA,用siRNA稀释缓冲液稀释
(B) 加1.2ul siRNA转染试剂到20ul siRNA转染培养基中,轻柔混合,室温放置5分钟。注意:虽然,对多种的细胞系有很高的转染效率,但siRAN转染试剂并不是对所有细胞都适合。
2,5分钟后,混合A和B,形成siRNA-siRNA转染试剂复合物,轻柔混合,室温孵育20分钟。
3,孵育后,加160ul siRNA转染培养基到每个含有siRNA-siRNA转染试剂复合物的管中,轻柔混合
从这一步起,对悬浮细胞和贴壁细胞的处理方法相同
4,转染前,吸弃培养基,用0.3ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次,去除培养基。
5,在洗过的细胞上,铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物,37度,5-7小时
6,孵育后,向含有转染细胞的每个孔中加200ul 生长培养基,其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍,无需去除转染混合物。如果,毒性是个问题的话,去除转染混合物,以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
7,孵育结束后,用新鲜正常生长培养基替换,继续孵育24-72小时
8,使用恰当的操作步骤检测细胞,参见免疫荧光染色步骤
13,半定量RT-PCR
cDNA合成
准备试剂:1ul oligo(dT) 12-18(500 µg/ml)
1 ng-5 µg 总 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去离子水补加到总体积12 µl
70℃ 孵育 5 分钟,迅速放在冰上,再加入
4 µl 5x反转录酶缓冲液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制剂
42℃孵育 2 分钟。
加1 µl 反转录酶(200 units)
42℃ 孵育 50 分钟,然后,
在70℃孵育15 分钟 终止反应
注意:作为优化的步骤,加1 µl RNase H (2 unit/µl)
37℃ 孵育20分钟
*轮PCR 反应:
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液(含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使体积达到50 µl
94℃孵育 2 分钟,变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。
第二轮 PCR 反应
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液(含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl *次PCR 产物,并补加水到50 µl
94℃孵育 2 分钟变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。
PCR产物在琼脂糖凝胶中,EB染色后可见。