EAE 模型诱导手册

EAE 模型诱导手册:

EAE模型是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的,以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病,是人类多发性硬化(MS)的理想动物模型,在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。

实验动物的选择成年雌鼠C57/BL6小鼠 8周  15只

试剂准备

产品

货号

包装

数量

品牌

购买单价

MOG (35-55)多肽蛋白

AS-60130

5 mg

1

AnaSpec

4545

百日咳毒素

list181

50µg

1

listlabs

3300

结核菌素H37Ra

231141

100mg

1

BD

5000

弗氏不*佐剂

8642862

10ml

2

Mpbio

150

器材准备

器材名

数量

无菌陶瓷研钵

1个

5ml玻璃注射器

1个

振荡器

1个

28G一次性注射针头

1盒

18G一次性注射针头

1盒

1ml一次性注射器

1盒

一次性三通管

1个

一次性塑料试管

1包

 试剂配制:

1:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG (35-55)配制: 将AnaSpec公司的MOG (35-55)多肽蛋白溶于PBS中,浓度为2mg/ml

2: 准备*弗氏佐剂(CFA):将BD公司的结核菌素H37Ra粉末溶于MPBIO公司的弗氏不*佐剂而成(终浓度为4MG/ML)

 称取80mg结核菌素H37Ra粉末与不*佐剂混合,注意每次加入一点点不*佐剂,在研钵中充分研磨保证结核菌素*悬浮。

3:将配好的MOG (35-55)溶液和*弗氏佐剂1:1混合(MOG终浓度为1MG/ML),保存于4度冰箱,并于24小时内使用

5:百日咳毒素(PTX)配制: 取一只listlabs公司的百日咳毒素粉末,在管子中加入500ulPBS溶液,浓度为100ug/ml,保存于4度冰箱,使用前再用PBS稀释100倍

 

实验步骤:

1:*天:小鼠胸腹部皮下注射接种MOG和Mtb/CFA混合液 ,复测2-4个点,共150ul/只。再腹腔注射稀释后的百日咳毒素溶液(浓度为1ug/ml)200ul/只

2:第三天:再加强注射百日咳毒素溶液(浓度为1ug/ml)200ul/只

 

 

 

 

 

ADAM细胞计数仪手册

ADAM细胞计数仪手册

ADAM MC2 & CellT

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

最准确的细胞计数仪

ADAM-MC2ADAM-CellT是自动荧光细胞计数器的新标准。ADAM代表高级检测和精确测量。ADAM采用灵敏的荧光染料染色、LED光学和CMOS检测技术,使细胞分析更加准确可靠。 它测量总细胞、活细胞、非活细胞的数量并显示活力结果。 结合一次性微流控芯片,操作现在非常简单、容易且具有成本效益。

 

活细胞计数原理 PlAO 染色法)

活细胞检测有两种方法。样品用荧光染料、碘化丙啶 (P) 或吖啶橙 (AO) 染色后,染料嵌入 DNA 对靶细胞的细胞核进行染色,ADAM 会自动拍摄荧光图像。获得的图像由系统内部集成的图像分析软件进行处理。

 

聚集和不规则形状的细胞计数

ADAM 通过计数聚集和不规则形状的细胞提供准确可靠的结果

基于细胞大小和形状的准确计数

聚合细胞的单个计数

碎片不包括在计数结果中

 

在左侧的图像中,右侧的图像表示已被 ADAM计数的细胞

 

准确性和重复性

DAM-MC2和流式细胞术之间总细胞计数的相关性。

 

ADAM 对低、中和高浓度的细胞样品进行计数各个细胞浓度水平的可重复性都很高。

 

 

 

活细胞计数比较

ADAM、流式细胞术和手动计数之间的细胞活力比较。 SH-SY5YJurkatHeLa细胞分别用100300μM H2O2处理3小时,流式细胞仪分析,人工计数。

 

 

细胞治疗中的应用

ADAM用作细胞治疗(CAR-T 细胞、干细胞等)过程中细胞数量和活力的监测和QC 设备此外,根据细胞治疗产品制造过程中需要监测的细胞类型(全血细胞、PBMC等),可以使用ADAM

 

应用的细胞类型

  1. 干细胞

  2. CAR-T细胞

  3. CAR-NK细胞

  4. 脂肪来源干细胞

  5. 全血细胞

  6. 聚集细胞

  7. PBMCs

     

     

    生产CAR-T细胞的QC平台

    使用 ADAM 可以轻松监控 CAR-T 细胞纯化、扩增和配制的所有不同步骤,以确保结果准确可靠。ADAM 可用于 CAR-Tcll cGMP、过程控制和质量控制。

     

     

     

    分离 T 细胞的性能测试

  • 准确性

    T细胞概况性能评估。

     

    流式细胞仪分析CD3 未分选(WBC;左图)或分选(分离的T细胞右图)人外周血淋巴细胞上表达情况。

     

     

    流式细胞仪与ADAM用于分 T 细胞计数结果的相关性

  • 线性

     

    ADAM-CellT 与使用分离 T 细胞的预期浓度之间的线性测试

     

  • 重复性

     

    ADAM 对分离的 T 细胞的低浓度、中浓度和高浓度样本进行计数

     

    活化 T 细胞的性能测试

     

    用于性能评估活化 T 细胞的表型

    流式细胞术分析 TCR刺激(活化T细胞;下图)或未刺激(对照T细胞;上图)T 细胞上的 CD25 表达情况

     

     

  • 活力

    比较流式细胞仪和 ADAM-CellT 在检测活化 T 细胞的活力值。

     

  • 重复性

    ADAM 对低、中、高浓度的活化 T 细胞样本进行计数。

     

     

    21 CFR 11 部分合规性

    DAM-CellT 是一种可用于 cGMP 生产环境的自动化细胞计数器。ADAM-CelIT 符合 21 CFR 11 部分,这是关于用于 cGMP 设施的电子记录和签名的规定。任何用户都不能修改数据。 用户的每个操作都记录在审计跟踪中,其中包括操作的日期、时间和具体细节。

     

  • 电子记录

    审计跟踪、数据管理以防止数据修改

Santa产品手册

Santa Cruz公司产品Protocols及相关支持产品

Santa Cruz生物技术公司为*抗体提供了高品质的支持产品。包括用于WB和IHC的自产的第二抗体, 用于IP研究的发光试剂,琼脂糖标记proteinA,proteinG PLUS和proteinL,用于WB的胞核提取,全细胞溶解物,组织提取试剂,WB膜,TransCruz凝胶迁移寡核苷酸,封闭物和实验室常用试剂。 提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量标准和预染分子量标准。ImmunoCruz染色系统用于IHC(石蜡切片)染色,为预稀释,即用系统。还介绍一系列凋亡检测试剂 盒。支持产品主要涵盖以下方面:1)WB 2)IP 3)IP/WB 4)免疫复合蛋白激酶检测 5)免疫过氧化物酶细胞染色 6)免疫荧光细胞染色 7)流式细胞技术(FCM)8)ELISA检测 9)TransCruz凝胶超迁移实验 10)用多肽中和抗体活性的方法 11)染色质免疫沉淀(ChIP)实验 12)siRNA转染 13)半定量RT-PCR 14)溶液配制。

1. WB

A.样品准备
注意:细胞培养基产品包括经典和特殊培养基,血清,培养基添加物,诱导物,抗生素。产品列表请登陆www.scbt.com。

单层细胞

室温下,移去培养基并用PBS冲洗直径100mm的培养皿。以下步骤均在冰上或4℃操作,使用冰预冷的新鲜缓冲液。
加入0.6ml RIPA裂解液(sc-24948)。4℃轻轻晃动细胞培养皿15min。用细胞刮将贴壁细胞刮下。转移裂解液至微量离心管内。

用0.3ml RIPA裂解液洗一次培养皿,将洗液与之前的溶解物合并。(可选择:加入10μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液和/或用21号注射器针头切割DNA)冰上孵育30-60min。
将细胞溶解物4℃离心,10000×g,10min。转移汉细胞裂解物的上清至新的离心管内,弃沉淀。

注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

悬浮细胞
室温低速离心5min,收集约2.0×107个细胞。小心除去培养基。
室温下用PBS冲洗细胞沉淀,再次低速离心5min,小心除去培养基。
加入1.0ml冰预冷的RIPA裂解液(sc-24948),裂解液中现用现加入蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂。用移液器轻轻悬浮细胞,冰上孵育30min。
 用21号注射器针头、杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化。注意不要使裂解物温度过高。(可选择:加入10μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液。)冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管,4℃离心,10000×g,10min。转移上清至新的离心管内,弃去沉淀。

注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

组织样品
称重组织块,并用干净的剃刀剪碎。冰冻组织可被切的很薄,并在含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(sc-24948)中解冻。3ml冰预冷的RIPA/g组织。
杜恩斯匀浆器或超声进一步破坏使细胞均质化,温度维持在4℃。(可选择:加入30μl 10mg/ml PMSF(sc-3597)储存液/g组织。)冰上孵育30min。
将裂解液转移至离心管,4℃离心,10000×g,10min。弃沉淀。可加长离心时间获得更好的裂解产物。

注意:涉及磷酸化作用研究时,可用PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集纯化细胞溶解物中的磷酸化蛋白。

B电泳

将样品(每个泳道全细胞提取物40-60μg,胞核提取物10-20μg或10-20ng纯化蛋白)与等体积2×电泳上样缓冲液(sc-24945)混合,煮沸2-3min。未用完的样品可保存在-20℃。
上样,10μl/1.0mm×0.75mm孔。
推荐使用Cruz MarkerTM分子量标准(sc-2035)。小胶(0.75mm)每孔上样2μl,大胶(1.5mm)每孔上样5μl。如用与Cruz MarkerTM一致的第二抗体,可看到用于检测试剂的内参条带。也可选择预染分子量标准(sc-2361)。
电泳步骤参考标准protocols。
根据厂家protocols,用电转装置将蛋白条带转移至NC膜或PVDF膜上。

注意:Cruz Blot SystemTM提供预制好的人或小鼠全细胞提取物和核提取物,或小鼠组织提取物。

C.Immunoblotting
用Blotto(BlottoA或B;用抗牛第二抗体时建议使用BSA)封闭膜上的非特异位点,室温孵育30-60min。也可选择用不含Tween-20的Blotto,在封闭容器内4℃过夜孵育。
如果使用的是磷酸化特异抗体,建议向封闭液和抗体稀释液中加入50 mM NaF(NaF:sc-24988)抑制磷酸化酶。
封闭好的膜与*抗体(Blotto稀释)稀释液室温孵育1小时。(如果是磷酸化特异抗体,要用加了50 mM NaF的Blotto稀释液。)抗体*浓度根据滴度决定。建议起始稀释度为0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次,5min/次。
将 膜与HRP或AP标记的第二抗体稀释液(Blotto稀释)室温孵育45min,稀释度1:500-1:2000。如果背景过高,第二抗体需进一步稀释 (可达1:20000)。作ECL时,如果使用Cruz MarkerTM分子量标准(sc-2035),必须使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作为可视化标准。
TBST洗膜3次,5min/次,然后TBS洗膜一次,5min。
将膜与化学发光试剂(sc-2408)孵育。如果发光化合物用于可见光检测,必须用HRP标记的第二抗体。

2.IP

注意:本操作步骤可用于放射性或正磷酸盐标记的细胞。(放射性物质的使用及处理应遵循适当的条例如OSHA和 NRC指导手册。)细胞标记必须在无待标记氨基酸残基或无磷酸盐的培养基中进行。建议标记前使细胞处于适当的饥饿状态。孵育培养细胞(100mm细胞培养 皿上约80-90%
单层细胞汇合或培养瓶内含约2-5×107个悬浮细胞)。通常,用传代贴壁细胞或2-5×107个悬浮细胞可得到*标记。

例如:除去培养基,加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的无蛋氨酸培养基。37℃孵育1h。某些蛋白需延长标记时间(18hrs)。有必要用PBS洗涤细胞除去未结合的放射物。

向单层传代细胞中加入1-3ml冰预冷的RIPA(sc-24948),4℃孵育10min。对于悬浮细胞则向离心管中加入RIPA洗涤细胞沉淀。
用21号注射器针头或超声波反复裂解细胞。转移裂解物至微量离心管中。
可选择:用1.0ml冰预冷的RIPA冲洗细胞培养皿,与之前的合并处理。
4℃,10000×g离心10min。冰上转移上清(细胞溶解液)至新的微量离心管。
预处理细胞溶解液,加入1.0μg的control IgG(与*抗体的种属来源一致)和20μl悬浮的(25%v/v)琼脂糖偶联物(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。4℃孵育30min。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s。
转移上清或约100-1000μg总细胞蛋白至微量离心管中。加入1-10μl(如0.2-2μg)*抗体(抗体浓度应滴定测定),4℃孵育1-2hrs。或者,可加入20μl*抗体琼脂糖偶联物,混匀,4℃孵育1hr-过夜;跳过下一步骤。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好管子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s,收集免疫沉淀物,小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次,每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后,小心吸弃上清,用40μl 2×电泳上样缓冲液(sc-24945)重悬沉淀。
样品煮沸2-3min,上样电泳分离免疫复合物,通过放射自显影观察结果。未用完的样品可保存在-20℃。
可选择:煮沸后,样品可经离心沉淀琼脂糖颗粒,然后SDS-PAGE分析上清。

3.IP/WB

按照之前描述的WB程序准备总细胞溶解物。

注意:如进行磷酸化研究,溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白纯化试剂盒(sc-24964)富集磷酸化蛋白。 

预处理全细胞溶解物(可选择步骤),约1ml全细胞溶解物或组织提取物,加入0.25μg适当的control IgG(与*抗体种属来源一致)和20μl悬浮的(25%v/v)琼脂糖偶联物(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂 糖)。4℃孵育30min。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s。转移上清(细胞溶解物)至干净的微量离心管。
1ml细胞溶解物或约100-1000μg总细胞蛋白,加入10μl*抗体琼脂糖偶联物,混匀,4℃孵育1hr-过夜。
可 选择:如无*抗体琼脂糖偶联物,1ml细胞溶解物加入1-10μl(如0.2-2μg)*抗体(抗体浓度应滴定测定),4℃孵育1-2hrs。加入 20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液(A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好管子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心30s,收集免疫沉淀物,小心吸弃上清。
用1.0ml RIPA裂解缓冲液或PBS轻轻洗涤沉淀2-4次,每次重复以上离心步骤。
zui后一次洗涤后,小心吸弃上清,用40μl 2×电泳上样缓冲液(sc-24945)重悬沉淀。
样品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上样孔上样5-10μl。
电泳并按WB程序作免疫杂交。

注意:选择不同的第二抗体,55kDa重链和27kDa轻链IgG,可检测到*抗体。如果以上步骤中采用*抗体琼脂糖偶联物则*抗体条带不明显。

4.免疫复合蛋白激酶测定
从100mm细胞培养皿(单层细胞80-90%汇合)移除培养基,PBS洗一次。
加入1-3ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液(sc-24948),4℃孵育10min。(注意:RIPA裂解缓冲液对某些激酶效果不好。需要优化裂解液成分来保持激酶活性。)
用21号注射器针头反复抽吸使细胞破碎充分,转移至15ml离心管中。
用1ml冰预冷的RIPA裂解缓冲液,0.5%Triton X-100(sc-29112)冲洗培养皿,与原裂解液合并。
10000×g,4℃离心10min。4℃转移上清至新的离心管内。
转移1.0ml细胞提取物(上清)至1.5ml离心管中。加入1-10μl(0.2-2μg)*抗体(抗体*浓度经滴定测定),4℃孵育1hr。
加入20μl适当的琼脂糖偶联物悬浮液((A蛋白-琼脂糖,G蛋白-琼脂糖,A/G蛋白-琼脂糖,或L蛋白-琼脂糖)。盖好盖子,4℃振摇孵育1hr-过夜。
2500rpm(约1000×g),4℃离心5min,收集免疫沉淀复合物。小心吸弃上清。
1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次,每次重复上述离心步骤。
 20μl 适当的蛋白激酶缓冲液重悬沉淀(如50mM HEPES(sc-29097),0.1mM EDTA(sc-29092),0.01%BRIJ 35(sc-29087)),0.1mg/ml BSA,0.1% β-巯基乙醇(sc-29086),0.15M NaCl(sc-29108)。缓冲液成分根据所研究的激酶调整。
加入10-1000ng多肽底物。该底物/酶/细胞系的多肽底物浓度应根据经验决定。
准备1ml ATP混合物:930μl适当的蛋白激酶缓冲液,6μl 50mM ATP,pH7.0,20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每个样品加入10μl ATP混合物,30℃孵育30min。冰上放置。
加 入等体积2×电泳上样缓冲液(sc-24945)终止反应,样品煮沸2-3min。样品可离心沉淀琼脂糖微珠(可选择);分析上清。跑SDS-PAGE, 通过放射自显影观察结果。未用完的样品保存在-20℃。检测中如用小肽底物,样品必须通过闪烁计数或其他标准方法而不是SDS-PAGE来分析。

5.免疫过氧化物酶细胞染色

A. 组织培养细胞

在无菌的盖玻片上培养细胞37℃过夜。PBS简单冲洗后按以下程序之一固定细胞:
1)-10℃甲醇溶液5min,自然干燥(推荐方法);或
2)冰丙酮2min,自然干燥;或
3)1%甲醛-PBS 10min(保持湿润)。
PBS洗三次。
可选择:含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次,5min/次。

B.冰冻组织切片

冰冻组织存放于液氮中。切片前(2周)可保存于-70℃。
95%乙醇清洁玻片,涂一薄层黏附剂,自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-10μm。室温贴片。切片保存在-70℃。固定染色前室温解冻切片。

注意:免疫组化切片固定剂清单包括Clarion和Crystal固定剂。

冰丙酮固定切片10min,冷藏。PBS洗三次。
可选择:含0.1-1%过氧化氢的PBS孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性。PBS洗2次,5min/次。
注意:组织内有丰富的生物素(引起高背景染色),建议甲醛固定,遵循石蜡包埋组织切片protocol,因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

C. 甲醛固定,石蜡包埋组织切片

按标准程序甲醛固定,石蜡包埋组织。
95%乙醇清洁玻片,涂一薄层黏附剂,自然晾干。或使用预处理的玻片。
切片厚度4-6μm。二甲苯脱蜡,3次,5min/次。依次过梯度酒精水化:100%乙醇,2次,10min/次,95%乙醇,2次,10min/次。去离子水浸洗1min。甩去切片上多余的液体。

可选择:可做抗原修复。甲醛固定和石蜡包埋导致某些抗原决定簇被封闭,可按以下方法修复暴露抗原位点:

i. 热修复(推荐方法):切片浸没入10mM柠檬酸钠缓冲液(sc-29109),pH6.0;或浸没入含0.01% (w/v)EDTA(sc-29092)的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(甘氨酸:sc-29096)中,pH3.5。95℃加热5min。换新的缓冲 液,95℃加热5min。(不同组织类型*孵育时间不同)。将切片放入缓冲液中冷却约20min。用去离子水洗3次,2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶:切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室温孵育10-20min。去离子水冲洗几次,甩去多余液体。
iii. 皂角苷:切片用含0.05%皂角苷的去离子水室温孵育30min。PBS至少洗3次,甩去多余液体。

可选择:切片在含0.1-1%过氧化氢的去离子水中孵育5-10min,淬灭内源过氧化物酶活性,PBS洗2次,5min/次。

注意:组织内有丰富的生物素(引起高背景染色),建议甲醛固定,遵循石蜡包埋组织切片protocol,因为石蜡包埋组织中内源性生物素被破坏。

D.免疫过氧化物酶染色

切片的免疫酶染色,建议用Santa Cruz的ABC染色试剂盒或ImmunoCruzTM染色试剂盒。ABC染色试剂盒利用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物作为检测物;而 ImmunoCruzTM染色试剂盒利用链亲和素辣根过氧化物酶复合物作为检测物,该体系包括所有预稀释好的第二抗体,即用型,也包括预稀释的*抗体。 所有染色体系中均有完整的protocol;以下为简化版protocol。
所有反应步骤均于室温下湿盒内完成。使用前试剂盒试剂要先恢复至室温。操作中切片不能过干。每步操作完用吸引管吸除试剂,避免切片过干。要用足够的反应液覆盖标本(通常100μl/张切片就足够了)。

ABC染色试剂盒

PBS稀释的1.5%封闭血清孵育1hr。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体室温孵育30min或4℃过夜孵育。抗体*反应浓度需经滴定确定;建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次,5min/次。
滴加预稀释的生物素化第二抗体或用含1.5%封闭血清的PBS稀释至1μg/ml的生物素化第二抗体,孵育30min。PBS洗3次,5min/次。
滴加亲和素生物素酶反应物,孵育30min。PBS洗3次,5min/次。
用提供的过氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出现理想染色止。注意监控单张切片的恰当显色时间。去离子水洗5min。可用苏木素(sc-24973)复染5-10s。迅速用去离子水洗几次。
梯 度酒精,二甲苯依次脱水:浸没入95%乙醇2次,10s/次,然后100%乙醇2次,10s/次,zui后二甲苯3次,10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加 1-2滴封片固定剂(如Clarion,sc-24942),盖上盖玻片(sc-24975),光学显微镜下观察。

ImmunoCruzTM染色试剂盒

滴加1-3滴血清封闭液孵育20min。甩去封闭液。
迅速加入1-3滴预稀释的*抗体。如果所用染色系统不含预稀释的抗体,就把*抗体用血清封闭液稀释至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS冲洗,然后切片浸没入PBS内洗2次,2min/次。甩去多余的液体。
滴加1-3滴生物素化第二抗体,孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP-链亲和素复合物,孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP底物混合物。显色30s-10min,或直至出现理想染色止。去离子水冲洗,然后切片浸没入去离子水内洗2次,2min/次。
复染,脱水,封片。(同ABC染色试剂盒)

6.免疫荧光细胞染色

切片准备同免疫酶染色,省去包括过氧化氢处理细胞在内的zui后一步。
每步操作完吸除反应液,但要避免样品过干。用足够的反应液覆盖样品(100-500μl/张切片)。
滴加含10%封闭血清-PBS,孵育20min,减少和IgG结合的非特异位点。理想的封闭血清和第二抗体为同种属来源。从切片上去除封闭血清。
滴加*抗体,孵育60min。抗体*反应浓度应滴定决定;建议用含1.5%封闭血清的PBS稀释至0.5-5.0μg/ml,PBS洗3次,5min/次。
滴加生物素标记或荧光染料标记的第二抗体(用含1.5%-3%封闭血清的PBS稀释至1-5μg/ml),孵育45min。PBS洗3次。如果使用荧光染料标记的第二抗体,须暗室孵育,并省略下步。
滴加链亲和素-荧光素,暗室孵育15min。链亲和素标记物浓度需经滴定决定;建议PBS稀释至10-20μg/ml。PBS充分洗净。
用水相固定剂或90%甘油PBS溶液封片。
选择适当的滤镜在荧光显微镜下观察。室温避光保存切片(UltraCruzTM固片剂:sc-24941)或保存在4℃(甘油/PBS固片剂)。

7.流式细胞仪技术

细胞表面染色

准备细胞
1) 溶解血红细胞。(注意:准备足够的细胞用于10份样品100μl/份检测)。
1ml全血加入14ml恢复至室温的1×FCM溶解液(sc-3621)中。
轻轻混匀,室温孵育3-5min。不要超过5min。
离心5min,弃上清,预冷的5ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
离心5min,弃上清,预冷的1ml 1×PBS轻轻重悬沉淀。
2)准备培养细胞。(注意:本protocol通常处理50ml培养细胞。单层细胞,切勿胰酶消化!用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗细胞1次。)
血球计数仪计数细胞。
1000rpm离心5min,弃上清,用足够的1×PBS轻轻重悬沉淀至终浓度为1×107细胞/ml。

各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。(20μl/106细胞。滴定抗体确定*浓度)。
每管加入100μl RBC溶解的全血或单细胞悬液。混匀,放在有盖的冰盒内孵育15-30min。
每管加入1.5ml FCM冲洗缓冲液(sc-3624),颠倒混匀。1000rpm离心5min,弃上清,500μl 1%多聚甲醛重悬沉淀。
测读分析数据。

细胞内染色

可用适当的活性物质刺激细胞。确保有未刺激细胞对照。
50ml离心管收集细胞。2000rpm离心5min,弃上清。
室温1×PBS 20ml重悬细胞。
细胞计数。
2000rpm离心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm离心5min除去PBS。
每106个细胞加入1ml 4℃ FCM固定缓冲液(sc-3622),冰育15-30min。
4℃1×PBS洗细胞2次,离心,弃上清。
每106个细胞加入1ml -20℃ FCM渗透缓冲液(sc-3623),逐滴加入混悬。冰育15min。
离心;4℃ FCM冲洗缓冲液(sc-3624)。
2000rpm离心5min,弃上清。每107个细胞加入1ml FCM冲洗缓冲液,然后等分细胞(106)至各待测管中。
细胞内着染:各管加入荧光染料标记的*抗体或isotype control。室温避光孵育1hr。

注意:为得到*结果应滴定荧光染料标记抗体。

1ml FCM冲洗缓冲液洗细胞2次, 500μl新鲜FCM冲洗缓冲液重悬。
24hrs内检测分析。

8.ELISA检测

包被微孔板,靶蛋白用50mM碳酸盐包被液(pH9.0)稀释。*包被浓度须经滴定,但纯化抗原通常为1μg/ml,50μl/孔。封好,4℃过夜孵育。
弃净液体。加入200μl/孔封闭液(含1%BSA和0.02%叠氮钠的PBS)封闭非特异结合位点。室温孵育1-2hrs或4℃过夜孵育。
弃净液体。含0.02%叠氮钠的PBS洗1次。湿润的微孔条可用塑料密封袋密封,4℃保存4周。用前,弃净多余的液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的待测样品和对照。抗体需梯度稀释测定滴度或用以前的工作浓度作筛选或半定量。室温孵育1hr。
含0.05%Tween-20(sc-29113)的PBS洗板3次,弃净液体。
加入50μl/孔封闭液稀释的1:100-1:1000的碱性磷酸酶标记抗体。*抗体浓度需滴定决定。室温孵育1hr。
弃净液体。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次,拍干,弃净液体。
乙醇胺缓冲液(10mM乙醇胺,0.5mM MgCl2(sc-29098),pH9.5)洗1次,弃净液体。
用乙醇胺缓冲液稀释底物(PNPP,sc-3720)至终浓度1mg/ml。加入50μl/孔。反应10-20min直到阳性对照OD405/490读数达1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA,pH7.5终止反应。OD405/490读数。

9、TRANSCRUZTM 超凝胶迁移检测

用多聚核苷酸激酶将[γ32p]-ATP 标记到寡核苷酸上,达到50,000cpm/ng
准备胶迁移缓冲液:10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
准备20ul的反应混合物,将3-10ug核抽提物,和1ug多聚dIdC溶解在20ul胶转移缓冲液中。加0.5ng标记的寡核苷酸探针,室温孵育20分钟。这组成了检测DNA-蛋白复合物的对照样品
为了检测抗体迁移或封闭DNA-蛋白复合物,按步骤3准备反应混合物,每20ul反应体积加1-2ul TransCruzTM 超凝胶迁移抗体。一般是在加了探针之后,才加抗体,但在加探针前加入抗体,可使结果加强
通过4% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(25-30ma),分开DNA和蛋白复合物。凝胶中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待胶干后,自动放射显影查看结果

10、肽的中和

对所有的santa cruz的亲和纯化的兔或山羊的多抗和单抗,都有相应的封闭肽做对照。通过将抗体和封闭肽的预先孵育,抗体对抗原的结合可以被阻止。
决定zui高的抗体稀释度,在这个稀释度下,可以一直获得理想的阳性结果。例如,H-Ras在免疫沉淀时,推荐的浓度是1ug/ml,但阳性结果是在50ng/ml。
封闭/竞争时,将抗体(抗体浓度按照以前提到的方法确定)和5倍重量的封闭肽混合在500ul的PBS中,室温孵育2小时,或4度过夜。
封闭/竞争后,用封闭缓冲液稀释抗体/封闭肽混合物,然后,按照所期望的实验的操作进行。

11,染色质免疫沉淀

注意:CHIP的实验步骤可以有很多不同版本,下面介绍的步骤适合大多数的实验
常温下,用PBS洗细胞,重悬细胞,使细胞数大约5*105个/ml(总细胞数2*107)。,
加甲醛,使终浓度为1%,室温孵育10分钟。
加甘氨酸至终浓度0.125M,终止交联反应
2000rpm,5分钟,离心细胞。用冷的PBS洗细胞一次
用6ml的裂解缓冲液重悬细胞,轻柔混合,2000rpm离心5分钟,收集粗提的核提取物。
再用PBS洗沉淀,沉淀可以冻存,或继续以下步骤。
用1.9ml的高盐裂解缓冲液重悬沉淀,转移到2ml的离心管中准备超声
超声条件需要优化,下面介绍的条件是在使用Sonics VC130和3mm的探头的基础上建立起来的:
在冰上操作,输出功率设置5(R)6,每隔30秒超声一次,共4次。
4°C,10,000rpm 离心15分钟,保存上清,确定上清中蛋白的浓度。
如果免疫沉淀,我们推荐100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz试剂(0.2—2ug)
注意:研究者可能希望使用连接有葡聚糖或磁珠的一抗,以便于选择后续免疫沉淀的试剂。有些情况下,将针对同一种蛋白不同表位的抗体联合使用会更好。
向染色质溶液加50ul Protein A/G-琼脂糖,4度,孵育30分钟,使其澄清,zui大速度,4度离心5分钟。
向上清中加一抗,4度孵育过夜。
加50ul Protein A/G –琼脂糖,4度孵育2小时。
12,000rpm离心20秒收获磁珠,并将管放在冰上
用1ml裂解缓冲液洗磁珠2次
用冲洗缓冲液洗磁珠四次
重悬磁珠在400ul洗脱缓冲液中
通过在67度水浴中孵育管子2小时以上,使反向交叉连接
离心去除磁珠,继续在67度水浴孵育上清过夜 Remove
10,000rpm离心3分钟去除残留的珠子,保留上清
分离DNA,用500ul 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提上清,剧烈振荡,14,000rpm离心3分钟分离两相。
保留水相,用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE)  反向抽提有机相一次,在汇集水相
用600ul 氯仿/异戊醇抽提汇集的水相
DNA可以用商业化的试剂盒浓缩。

12. siRNA小干扰RNA

转染
*天:准备细胞
健康的细胞是成功转染的要求,在转染前明确细胞的生存状态
对于贴壁细胞:
1,吸弃培养基,用胰蛋白酶、EDTA、或其他合适的方法分散细胞,在胰蛋白酶化前,用无菌的1X PBS漂洗细胞2次。
2,一旦细胞分散,用4倍体积的含10% 胎牛血清不含抗生素的生长培养基(如DEME,RMPI1640)稀释悬浮液 。
(注意:这个阶段使用不含抗生素的培养基是转染成功的关键)
3,1,000 rpm离心5分钟,去除培养基,用不含抗生素的培养基重悬沉淀
4,转移细胞到12孔的细胞培养板 以便细胞过夜培养后,细胞覆盖率达60-80%
(注意:细胞覆盖率也是成功转染的关键)
对于悬浮细胞:
1,1,000 rpm离心5分钟
2,去除培养基,用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培养基重悬沉淀
3,转移细胞到12孔的细胞培养板或转到多聚赖氨酸包被的8孔板中,以便细胞过夜培养后,细胞覆盖率达60-80%
(注意:多聚赖氨酸包被是使悬浮细胞黏附到板底必须的)
第二天
 准备转染试剂和转染
 注意:对于不同的实验目的有不同的操作步骤,请根据试验需要选择下面介绍的操作步骤。
对于蛋白和转录检测
注意:当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时,转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1,对每一次转染,在一个无菌的小管里准备下面的混合物 这一步无关细胞培养类型
 (A) 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA转染培养基中,轻柔混合,在室温中放置15分钟 (注意:如果需要低浓度的siRNA,用siRNA稀释缓冲液进行稀释)
(B)加2.4ul siRNA转染试剂到40ul的siRNA转染培养基中,轻柔混合,室温放置5分钟。
注意:虽然siRNA转染试剂对许多细胞都有很高的转染效率,但并不是适用于所有的细胞
 2, 5分钟后,混合A和B形成siRNA-siRNA转染试剂混合物,轻柔混合,室温孵育20分钟。
 3, 然后,向每个含有siRNA-siRNA转染试剂混合物的管中加入0.32ml的siRNA转染培养基,轻柔混合
对贴壁细胞:
    4.1转染前,吸弃培养基,用1ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次,弃培养基。
4.2在洗过的细胞上,铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物,37度,5-7小时
4.3孵育后,向含有转染细胞的每个孔中加0.4ml 生长培养基,其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍,无需去除转染混合物。如果,毒性是个问题的话,去除转染混合物,以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
4.4孵育结束后,用新鲜正常生长培养基替换,继续孵育24-72小时
4.5从细胞中吸弃培养基,用1ml 1*PBS洗细胞一次,然后丢弃
4.6放置在冰上,向孔中加入300ul 1*电泳缓冲液,用移液器吹打,混匀。(注意:混合物可能变得粘稠)
如果进行Western blot的话,转移混合物到15ml的锥形管中,放在冰上,对混合物进行超声波降解,每15秒一次,用输出功率的40%。如果,超声后,起很多泡泡,1000转/秒,离心3分钟,然后,按照western blot的方法进行电泳,免疫印迹。
如果做转录分析,按照我们的半定量RT-PCR的操作进行。
对悬浮细胞
4.1在转染前,1000转/秒, 离心5分钟收集细胞。去除培养基,用1ml 无菌的siRNA转染培养基 。
4.2 再次离心1000转/秒,5分钟,去除培养基。用稀释的siRNA-siRNA转染试剂复合物重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板,37°C孵育5-7小时,每次单独转染时重复。
4.3孵育后,加0.4ml含2倍正常血清和抗生物浓度的生长培养基到每个含被转染细胞的孔中,不要去除转染混合物。如果有毒性的话,去除转染混合物,代替以正常生长培养基,在额外孵育18-24小时。
4.4一旦孵育结束,离心细胞,去除培养基。用新鲜的正常生长培养基重悬细胞。转移细胞到12孔组织培养板,继续孵育24-72小时。
如果  需要做western blot分析,则继续以下步骤
转 移混合物到15ml的锥形管中。将2*电泳上样缓冲液用Milli-Q超纯水稀释到1* 。1000转离心5分钟,收集细胞,去除培养基,用1ml PBS洗细胞,重复一次,用300ul 1*电泳上样缓冲液重悬细胞,放在冰上,对混合物进行超声波降解,每15秒一次,用输出功率的40%。如果,超声后,起很多泡泡,1000转/秒,离心3 分钟,然后,按照western blot的方法进行电泳,免疫印迹。
如果需要转录分析,参照半定量RT-PCR步骤。

免疫荧光检测
注意:当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时,转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。
1,准备以下混合物:
(A)加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA转染培养基中,轻柔混合,在室温放置5分钟  注意:如果需要低浓度的siRNA,用siRNA稀释缓冲液稀释
(B) 加1.2ul siRNA转染试剂到20ul siRNA转染培养基中,轻柔混合,室温放置5分钟。注意:虽然,对多种的细胞系有很高的转染效率,但siRAN转染试剂并不是对所有细胞都适合。
2,5分钟后,混合A和B,形成siRNA-siRNA转染试剂复合物,轻柔混合,室温孵育20分钟。
3,孵育后,加160ul siRNA转染培养基到每个含有siRNA-siRNA转染试剂复合物的管中,轻柔混合
  从这一步起,对悬浮细胞和贴壁细胞的处理方法相同
4,转染前,吸弃培养基,用0.3ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次,去除培养基。
5,在洗过的细胞上,铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物,37度,5-7小时
6,孵育后,向含有转染细胞的每个孔中加200ul 生长培养基,其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍,无需去除转染混合物。如果,毒性是个问题的话,去除转染混合物,以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时
7,孵育结束后,用新鲜正常生长培养基替换,继续孵育24-72小时
8,使用恰当的操作步骤检测细胞,参见免疫荧光染色步骤

13,半定量RT-PCR

cDNA合成
准备试剂:1ul oligo(dT) 12-18(500 µg/ml)
1 ng-5 µg 总 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去离子水补加到总体积12 µl
70℃ 孵育 5 分钟,迅速放在冰上,再加入
4 µl 5x反转录酶缓冲液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制剂
42℃孵育 2 分钟。
加1 µl 反转录酶(200 units)
  42℃ 孵育 50 分钟,然后,
在70℃孵育15 分钟 终止反应
注意:作为优化的步骤,加1 µl RNase H (2 unit/µl)
37℃ 孵育20分钟

*轮PCR 反应:
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液(含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使体积达到50 µl
 94℃孵育 2 分钟,变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。

第二轮 PCR 反应
准备以下试剂
5 µl 10x PCR 缓冲液(含或不含MgCl2)
*5 µl 25 mM MgCl2 (调整不同的MgCl2浓度,推荐终浓度 2.5 mM)
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物对 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl *次PCR 产物,并补加水到50 µl
94℃孵育 2 分钟变性 cDNA.
进行的15–40 个循环的 PCR.退火和延伸反应是根据引物和模板情况依经验而确定的。
PCR产物在琼脂糖凝胶中,EB染色后可见。

PEI转染手册

                                         PEI转染手册

 

转染操作流程:
 
  1、细胞传代:

转染前24h内分离293T细胞至含10%胎牛血清的DMEM培养基 中进行传代培养,接种密度如下:
         6孔板:0.5×106细胞
         10cm培养皿:4.0×106细胞
         15cm培养皿:9.0×106细胞

2、转染

转染前将所有试剂置于室温。

2.1质粒DNA的稀释

在无菌试管中,用无血清的DMEM W / O酚红培养基(浓度为10%)稀释质粒DNA(ug)。病毒包装体(psPAX2):病毒包膜(pMD2G)和重组质粒DNA的稀释比例分别为4:2:1。
       

6孔板:200ul+3ug的DNA
        10cm培养皿:1ml+7-8ug的DNA
        15cm培养皿:2ml+11-12ug的DNA

   2.2 转染复合体形成

将PEI(1ug/uL)加入已稀释的总DNA中,PEI与DNA(ug)的混合比率为3:1。加入后立即涡旋混合。
      

 6孔板:9ul PEI复合体(1ug/ul)=9ug
        10cm培养皿:21ul PEI复合体(1ug/ul)=21ug
        15cm培养皿:33ul PEI复合体(1ug/ul)=33ug
将添加到细胞的DNA/ PEI的混合物在室温下孵育15分钟。

4、收获转染细胞

转染后48小时内收获转染细胞/或病毒上清。
 
试剂的配制:
PEI(1ug/ul)
1、将无内毒素的无菌水加热至80℃左右溶解PEI,冷却到室温。
2、调整pH值至7.0,用0.22um的滤器过滤消毒,分装后储存在-20℃。工作液可保持在4℃

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线性聚乙烯亚胺 分子量25000

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