胶原蛋白的分析

新鲜、冷冻和福尔马林固定的组织

介绍

从组织中提取胶原的效率较低且可变，可能是由于成熟胶原中存在交联。因此，定量分析胶原蛋白的

一种常用方法是对组织进行酸水解，然后用HPLC或比色法测定羟脯氨酸。该方法适用于组织和组织提取物。

然而，组织储存的主要方式是作为石蜡包埋的福尔马林固定组织。到目前为止，组织学染色和图像分析是分析石蜡包埋组织的方法。这种方法确实提供了关于组织中胶原蛋白定位的定性信息，但只是半定量的。

我们设计了一种定量和易于分析福尔马林固定石蜡包埋的组织或组织切片中的胶原蛋白的方法。不需要用二甲苯等有毒溶剂去除石蜡，也不需要使用特殊设备。该方法的灵敏度是，仅适用于少量10µm组织切片定量胶原。

在这个应用说明中，我们展示了在新鲜或冷冻组织、福尔马林固定组织和石蜡包埋组织中易于进行每个蛋白分析的数据和方法。

图1.

不同类型组织中总胶原和总蛋白分析示意图

方法

.1该程序的表示形式如图所示。将5-10个10µm组织切片（或相应数量的新鲜或福尔马林固定组织）转移到萨斯特管中，加入150µl6M盐酸，在95时通过o/n孵育水解oC在热块中。

水解后，在不进行任何预处理的情况下，35µl用于胶原定量测定(测定时间90min)， 15µl用于快速酶蛋白测定(测定时间30min)，这是专门用于酸水解物中的蛋白质分析的方法开发的。蛋白质数据被用作用于水解的未知数量的组织的归一化。结果在冷冻组织、石蜡化和脱亲和的组织切片中，胶原蛋白和蛋白质的比例相似样品处理，如甲醛固定、石蜡包埋和二甲苯处理脱除样品，不影响胶原蛋白和蛋白质分析（图2）。

图2.

以不同方式处理的组织中的胶原蛋白/蛋白质比例 在甲醛固定石蜡包埋的人动脉组织中分析胶原蛋白。将冷冻组织、10µm石蜡包埋组织切片或10个经二甲苯预处理的10µm组织切片 水解，并使用快速酶总胶原试验和快速酶蛋白试验进行进一步分析

每个蛋白质的胶原蛋白的结果与每个湿重分析的胶原蛋白相似

每毫克组织湿重的胶原蛋白和每毫克蛋白质的胶原蛋白给出了类似的结果(见表1A和表1B)。因为并不是针对所有的应用程序(例如。当使用福尔马林固定的组织时)，可以确定湿重或干重，酸水解酸中的蛋白质分析为组织中的胶原蛋白分析提供了新的机会。

表1A。不同小鼠组织的每湿重胶原蛋白分析机构

表1B。不同小鼠组织的胶原蛋白分析

从不同类型的（纤维化）组织的切片中提取的胶原蛋白和蛋白质分析从组织切片开始，例如小鼠肾纤维化(UUO)、肺纤维化（博莱霉素诱导）和肝纤维化(NASH)。从10个10µm石蜡包埋切片中测定总胶原蛋白/总蛋白。3)，并被发

现在纤维化条件下增加。

图3在各种纤维化和非纤维化组织中处理的组织中的胶原/蛋白比例

在小鼠肾纤维化(UUOvsSham)肺纤维化(博莱霉素vsPBS)和饮食诱导的NASH(西 方饮食加胆固醇vs对照组)的甲醛固定石蜡包埋组织中分析总胶原蛋白/总蛋白。对10个10µm组织切片进行水解，并使用快速酶总胶原分析和蛋白分析

结论

在新鲜、冷冻或福尔马林固定石蜡包埋组织中，胶原蛋白和总蛋白的定量现在可以以一种快速和简单的检测格式进行，而不需要HPLC或其他特殊设备。QuickZyme生物科学公司开发了一套用于分析任何物种的胶原蛋白的分析方法，每一种都有不同的应用领域胶原蛋白 相关的 化验 可用的 在 激酶 生物科学激酶可溶性胶原蛋白测定

快速Zyme总胶原检测

激酶羟脯氨酸测定

快速zyme蛋白测定

激酶可溶性胶原蛋白测定

该检测方法可识别可溶性或（酸/胃蛋白酶）可溶性胶原蛋白。

该检测方法是比色法，有96孔板格式，并基于胶原蛋白与天狼星红的沉淀。这种染料可以结合碱性氨基酸残基的侧链基团。染料在高pH下从沉淀配合物中释放，然后进行比色检测。基于天狼星红的检测可以识别胶原蛋白，但也有其他一些基质相关蛋白可能共同沉淀。

应用：该测定方法用于测定（可溶性）胶原蛋白。细胞培养基，以及（酸或酸/胃蛋白酶）溶解的胶原蛋白e。g.从 细胞提取物。

quickzyme 总胶原检测

该方法可识别所有类型的胶原蛋白，无论其形式如何（成熟、未成熟、前胶原蛋白、降解胶原蛋白、交联胶原蛋白、来自不同来源的胶原蛋白）。

该检测方法是比色法，具有96孔板格式，并基于羟脯氨酸的定量，这是一种只存在于胶原蛋白中的氨基酸。羟脯安酸在含胶原样品的酸水解后释放出来。水解在95点进行0C，该产品可直接用于羟脯氨酸分析，无需进步洗涤或干燥步骤。该分析是基于已建立的氯胺T/DMBA方法。

应用范围：该测定方法用于测定总胶原蛋白。由于一是样品的*水解，胶原蛋白的提取困难没有任何作 用。该检测方法适用于所有类型的样本，包括组织。

激酶羟脯安酸测定

该测定方法与总胶原测定方法相似，不同之处在于没有包括胶原水解的方案和材料，而没有提供胶原标准

，而是羟脯安酸标准。

应用：该方法与总胶原检测具有相同的应用区域，但适用于有自己的水解方法或有水解样品进行分析的客户。

quickzyme蛋白测定

该方法测定蛋白质水解产生的游离氨基酸。该方法采用比色法，可直接对酸水解物进行。

应用：该方法旨在测量酸水解物中的总蛋白，当不可能进行基于重量的归一化、不方便或变化太大时，提供总 胶原蛋白和羟脯安酸值的归一化。