荧光标记二抗的选择

一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA,zui常用的二抗是酶标二抗;而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。如果想要更 大程度的放大检测信号,可以使用Biotin/Avidin检测系统。其中荧光素是具有光致荧光特性的染料,荧光染料种类很多,目前常用于荧光标记二抗有 以下几种:
【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】
FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4,zui大吸收光波长为490~495nm,zui大发射光波长为 520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用zui广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物,每一个抗体可标记 几个FITC分子,IgM通常用小分子的荧光素标记,如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的zui大缺点是淬灭快,因此要和抗淬灭剂一起 使用。
【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC),Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】
这 些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm)和zui大发射波长(570, 590, 620nm)。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用,使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜 作三标记的实验时,RRX尤其有用,可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用,因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间,而且和这两者覆盖都很 少。氪氩灯激发光为488nm,598nm和647nm,分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标,另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物,呈紫红色粉末,较稳定。zui大吸收光波长为 550nm,zui大发射光波长为620nm,呈现橙红色荧光,与FITC的绿色荧光对比鲜明,可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢,也可用于单独 标记染色。
【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】
Cy2 耦联基团激发波长为492nm,发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含 有磷酸化的苯二胺的封片剂,因为这种抗淬灭剂和Cy2反应,在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮,更稳定,背景 更弱。Cy3耦联基团激发光的zui大波长为550nm,zui强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中,可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50%的光强,在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约
75%。 Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长zui大650nm,发光波长zui大 670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98%的荧光,在氦氖灯下(633nm)为63%。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的 实验中。由于它的zui大发射波长在670nm,Cy5很难用裸眼观察,而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共 聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时,不推荐使用Cy5。
【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】
存 在于被称为藻红的多聚微粒中,位于叶绿素的反应中心,在自然结构中,藻红蛋白吸收光能,吸收后转化成能量,供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后,其蛋 白质变得具有很强的荧光,能吸收不同波长的光,发出亮红色的荧光,此时不再接受任何外来的光,也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广,zui大的吸 收波长为566nm,zui大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点:首先具有强的长波长激发和发射荧光,可避免来自其他生物材料荧光 的干扰;并且具有*的发射量子产率;另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。
【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】
耦 联的AMCA吸收光波长zui大为350nm,发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说,AMCA可以用汞灯来激发,用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号 相对较弱,单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围,而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠,因此它 zui常用于多标记实验中,比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光,在多标记的实验中,AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗 原。AMCA和荧光素一样很快淬灭,使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光,因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量 存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中,AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发,因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
注:由于观察荧光需要一 定波长的激发光,必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外,多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如,若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求,则Cy3和Cy5就比其他 的荧光团探针要亮。
西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供zui完整的二抗产品线。主要二抗品牌为zui大的二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生 产商 ProteinTech。针对荧光标记二抗,有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二 抗;按照检测物种分,有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛,以及多种细菌类二抗;另外,还有IgG、IgA、IgM以及 IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同类型抗体。

Miltenyi磁柱选择及标记问题

一、标记策略

用MACS进行磁分离,zui重要的参数就是高质量的标记。对阳性细胞的标记应尽可能强,而背景要尽可能低,才能获得对磁标记的阳性细胞和未标记的阴性细胞的分辨。有多种不同的标记策略可供参考:

1、直接标记

直接标记是zui快速和zui特异的磁标记方法。

2、间接标记

几乎所有的单克隆抗体或多克隆抗体都可以用于间接标记。用无标记的、生物素化的或FITC、PE或APC结合的一抗标记细胞,再用抗免疫球蛋白、抗生物素、链霉菌亲和素、抗FITC、抗PE、或抗APC的微珠分别进行磁标记。间接标记可以放大磁标记,用于分离表达比较弱的标记很有用。在间接标记中,以使用生物素化的或PE表记的一抗结果特异性。

二、磁分离柱的选择

下表为德国Miltenyi公司的分离柱种类,其中 MS, LS, XS柱适合于正性细胞选择,如果磁标记很强,也可用于负性选择。Large Cell Columns与MS柱相比,孔径较大,适合于人和动物大细胞的正性选择,如巨核细胞。新的LD柱是为zui方便的负选设计,代替了AS 和BS柱。LD 柱和CD及D柱即使在磁标记很弱的情况下也能获得zui高的负选效率。µ 和M柱是为分子生物学方面的应用而设计的。

三、分选策略

分选策略也要根据实际情况进行选择

1、正性选择(positive selection)

磁珠对细胞功能和活力的影响很小,因此一般首先应该考虑正选策略。正选具有速度快和单克隆抗体的特异性优势,大多数情况下,正选省时省钱。

2、负性选择(negative selection)

如果正选策略不适合您的实验,比如有可能因抗体结合引起细胞活化或没有针对靶细胞的特异性抗体,可以选择负选策略。MACS

附:Miltenyi分离柱技术指标及图片

D-荧光素钾盐在细胞标记方面具有重要作用

  D-荧光素钾盐是一种常用的生物染色剂,广泛应用于生物学、医学和环境科学等领域。具有高荧光强度、选择性好、稳定性强等特点,因此在细胞标记、免疫组化、荧光定量PCR等实验中得到了广泛应用。
  

 

  D-荧光素钾盐的主要作用:
  
  1.在细胞标记方面具有重要作用。通过将其与细胞特异性抗体结合,可以实现对特定细胞的标记。这种标记方法具有高灵敏度和高选择性,可以用于观察细胞形态、定位细胞器和蛋白质等。还可以用于活细胞成像,通过激光共聚焦显微镜等设备,可以实时观察细胞内分子的运动和相互作用,为研究细胞功能提供了重要手段。
  
  2.在免疫组化实验中也发挥着重要作用。免疫组化是一种检测特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平的方法。通过与抗体结合,可以实现对目标蛋白质的高灵敏度检测。这种方法具有操作简便、结果直观等优点,被广泛应用于病理学、肿瘤学等领域。
  
  3.用于荧光定量PCR实验。荧光定量PCR是一种基于荧光信号的变化来定量分析目标基因的方法。将其作为荧光探针,可以实现对目标基因的定量检测。这种方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点,被广泛应用于病原体检测、基因表达分析等领域。
  
  4.可以用于环境科学领域的研究。通过与污染物结合,实现对水体、土壤等环境中污染物的快速检测和定量分析。这种方法具有操作简便、结果准确等优点,为环境保护和污染治理提供了重要手段。
  
  D-荧光素钾盐作为一种重要的生物染色剂,在细胞标记、免疫组化、荧光定量PCR等领域具有广泛的应用前景。然而,在使用过程中需要注意其潜在的毒性和经济性问题。

Jena Bioscience荧光标记核苷酸

Jena Bioscience荧光标记核苷酸

标记核苷酸是生命科学研究的关键要素,是分子生物学中检测特定核苷酸序列的有效工具,通过酶的作用即可结合到DNA/RNA序列中,进行测序和分析。由于出色的安全性、稳定性和便捷性,生物素和荧光标记是用于原位杂交、基因表达谱分析或电泳迁移率转移分析(EMSA)的核酸探针的最常见标记。

产品应用

核酸序列测定(Southern/Northern印记)

Hi-C技术,捕捉染色质构象

菌落与噬菌体,细胞与染色体的原位杂交

基因表达分析

治病病原体检测

遗传病与肿瘤诊断

金畔生物是德国Jena Bioscience代理商,更多产品信息欢迎直接与我们联系


荧光标记核苷酸

货号

产品名称

荧光

NU-803-AMCA

AMCA-6-dUTP

AMCA

NU-803-DEAC

DEAC-dUTP

DEAC

NU-803-425

Aminoallyl-dUTP-ATTO-425

ATTO 425

NU-803-XX-425

Aminoallyl-dUTP-XX-ATTO-425

ATTO 425

NU-803-XX-AF488

Aminoallyl-dUTP-XX-AF488

AF488

NU-803-XX-488

Aminoallyl-dUTP-XX-ATTO-488

ATTO-488

NU-803-FAMX

Fluorescein-12-dUTP

荧光素

NU-803-RHOX

Rhodamine-12-dUTP

若丹明

NU-803-XX-532

Aminoallyl-dUTP-XX-ATTO-532

ATTO 532

NU-803-Cy3

Aminoallyl-dUTP-Cy3

Cy3

NU-803-XX-CY3

Aminoallyl-dUTP-XX-Cy3

Cy3

NU-803-XX-AF555

Aminoallyl-dUTP-XX-AF555

AF555

NU-803-550

Aminoallyl-dUTP-ATTO-550

ATTO-550

NU-803-TXR

Aminoallyl-dUTP-Texas Red

Texas Red

NU-803-XX-TXR

Aminoallyl-dUTP-XX-Texas Red

Texas Red

NU-803-XX-AF594

Aminoallyl-dUTP-XX-AF594

AF594

NU-803-XX-594

Aminoallyl-dUTP-XX-ATTO-594

ATTO 594

NU-803-CY5

Aminoallyl-dUTP-Cy5

Cy5

NU-803-XX-CY5

Aminoallyl-dUTP-XX-Cy5

Cy5

NU-803-647N

Aminoallyl-dUTP-ATTO-647N

ATTO 647N

NU-803-643

Aminoallyl-dUTP-ATTO-643

ATTO 643

NU-803-XX-643

Aminoallyl-dUTP-XX-ATTO-643

ATTO 643

NU-803-XX-AF647

Aminoallyl-dUTP-XX-AF647

AF647

NU-803-655

Aminoallyl-dUTP-ATTO-655

ATTO 655

NU-809-FAMX

Fluorescein-12-dCTP

生物素

NU-809-RHOX

Rhodamine-12-dCTP

若丹明

NU-809-Cy3

5-Propargylamino-dCTP-Cy3

Cy3

NU-809-550

5-Propargylamino-dCTP-ATTO-550

ATTO 550

NU-809-TXR

5-Propargylamino-dCTP-Texas Red

Texas Red

NU-809-CY5

5-Propargylamino-dCTP-Cy5

Cy5

NU-809-647N

5-Propargylamino-dCTP-ATTO-647N

ATTO 647N

Jena Bioscience生物素标记核苷酸

Jena Bioscience生物素标记核苷酸

标记核苷酸是生命科学研究的关键要素,是分子生物学中检测特定核苷酸序列的有效工具,通过酶的作用即可结合到DNA/RNA序列中,进行测序和分析。由于出色的安全性、稳定性和便捷性,生物素和荧光标记是用于原位杂交、基因表达谱分析或电泳迁移率转移分析(EMSA)的核酸探针的最常见标记。


产品应用

核酸序列测定(Southern/Northern印记)

Hi-C技术,捕捉染色质构象

菌落与噬菌体,细胞与染色体的原位杂交

基因表达分析

治病病原体检测

遗传病与肿瘤诊断

金畔生物是德国Jena Bioscience代理商,更多产品信息欢迎直接与我们联系