如何测量小鼠组织中的胶原蛋白？

介绍
胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质。胶原蛋白的准确分析对于胶原蛋白发挥重要作用的疾病研究以及纯化胶原蛋白在生物医学、化妆品或营养品行业的应用都很重要。
虽然胶原蛋白是人体的主要成分，但它是一种难以纯化和定量的分子。这部分是由于胶原蛋白分子通过不同类型的
交联，使胶原蛋白分子不溶，难以提取。
商用胶原蛋白分析的数量和类型有限。基于用天狼星红沉淀胶原蛋白分子，存在一些可溶性胶原蛋白的检测方法。然而，这种方法似乎不太适用于组织中胶原蛋白的分析。*泛使用的胶原蛋白分析是基于胶原蛋白水解为游离氨基酸，然后用HPLC或比色法测量胶原蛋白特异性羟脯安酸。然而，这些分析方法费时费力，需要特殊设备。为了克服这些缺点，我们最近开发了QuickZyme总胶原蛋白测定法，该法基于酸水解和比色检测的相同成熟原理，但速度更快，无需特殊设备。
在本应用说明中，我们比较了不同的测定方法，以测定各种小鼠组织中胶原蛋白的能力。我们使用QuickZyme总胶原蛋白测定法（酸水解，羟脯安酸比色检测）、HPLC“金标准”法（酸水解，羟脯安酸HPLC检测）和QuickZyme可溶性胶原蛋白测定法（酸/胃蛋白mei提取，天狼星红结合，比色检测）。

方法
处死健康小鼠（C57Bl6，8-10周龄），分离以下组织：肺、肝、肾、脾、心和真皮。此外，我们还以牛肌腱为样本。将组织/器官分为三部分，其中一部分用于湿重测定、干重测定（在冷冻干燥组织后）、在6 M HCl中的酸水解（10 mg湿组织/100µl 6M HCl，最小体积为200µl）以及通过HPLC或使用比色QuickZyme总胶原蛋白测定法定量羟脯安酸。另一部分直接用于湿重测定，然后使用QuickZyme总胶原蛋白测定法进行酸水解和羟脯安酸定量。第三部分用于湿重测定，用0.5 M醋酸/胃蛋白每过夜培养提取胶原蛋白，然后离心，并使用天狼星红可溶性胶原蛋白测定法进行定量。各种化验的化验原理见图1。

图1：。可溶性胶原蛋白测定法（左）、HPLC法总胶原蛋白测定法（中）和比色法总胶原蛋白测定法（右）的测定原理

后果
-通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色法对胶原蛋白进行定量，两者之间的相关性非常好，并产生类似的值

图1：HPLC和羟脯安酸比色分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg湿组织

水解可以用湿组织进行，也可以用干组织进行，结果相似。

图2：湿组织和干组织中羟脯安酸分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg组织

-用基于天狼星红的可溶性胶原蛋白分析法分析各种组织中的可溶性胶原蛋白，得出了不同的结果，其值远低于总胶原蛋白的值，许多组织甚至接近检测极限。与QuickZyme总胶原蛋白测定法相比，可溶性胶原蛋白分析法测得的总胶原蛋白水平要低得多，例如肺2.5%，肾10%，脾8%，真皮9%，肌腱3%。低值可能是由于从大多数组织中提取的成熟胶原蛋白不足。
-用不同方法测量的各种组织中的胶原蛋白含量如表1所示。很明显，每个器官的胶原蛋白水平各不相同，肌腱的胶原蛋白含量最高，其次是皮肤、肺、脾、肾、心脏和肝脏。

表1 通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色分析，分析各种组织中胶原蛋白的近似量（每毫克湿重组织中含有µg胶原蛋白）。

-组织在6 M HCl（最小体积HCl 200µl）中以100 mg/ml（湿重，湿重/干重比见表3）水解，水解产物用4M HCl稀释，如表2所示，35µl稀释水解产物用于总胶原蛋白分析（根据分析手册中的方案）。如表2所示，使用QuickZyme总胶原蛋白分析的最佳稀释因子因组织而异。确定该稀释系数时，应确保不存在基质效应（如果样品稀释不足，则会发生），且该值符合标准线的范围。

-各种组织的湿重与干重之比介于5.0（肺）和3.5（肌腱和皮肤）之间。湿组织或干组织中的胶原蛋白分析得出了类似的结果（数据未显示）。
-在肝组织水解物中，由于稀释程度较低的样品中出现基质效应，稀释因子为5-10。这导致OD值较低（接近或低于标准线中的低浓度）。因此，对于这种类型的组织，我们开发了一种改良的胶原蛋白分析方法，在该方法中未观察到基质效应，因此不需要稀释水解物（见第7页的说明，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析）。

 结论
•每个组织的胶原蛋白含量不同：肌腱>皮肤>肺>肾>脾>心脏>肝脏
•基于天狼星红的胶原蛋白分析不太适合组织中的胶原蛋白分析，可能是因为从组织中提取的胶原蛋白有限
•定量组织中胶原蛋白的最佳方法是充分水解组织，然后通过HPLC或比色法分析羟脯氨酸
•QuickZyme总胶原蛋白分析非常适合组织中的胶原蛋白分析，结果与HPLC相似，但快速、简单，不需要特殊设备。
•对于胶原蛋白含量低、基质效应大的组织样品，我们开发了QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析。

QuickZyme Biosciences已开发了一系列用于分析任何物种胶原蛋白的分析方法，每种方法都有不同的应用领域
QuickZyme Biosciences提供胶原蛋白分析：
•QuickZyme可溶性胶原蛋白分析
•QuickZyme总胶原蛋白测定
•QuickZyme羟脯安酸测定
•QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析
•QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定

QuickZyme可溶性胶原蛋白测定
该分析可识别可溶性或（酸/胃蛋白每）可溶性胶原蛋白。该分析为比色法，采用96孔板格式，基于胶原与天狼星红（一种含磺酸基的阴离子染料）的沉淀。这种染料可以结合碱性氨基酸残基的侧链。染料在高pH下从沉淀的络合物中释放，然后进行比色检测。该分析经过优化，以使其他蛋白质（如白蛋白）不会干扰。明胶（未折叠的胶原蛋白）不被该分析所识别。
应用：该方法用于测定细胞培养条件培养基中的可溶性胶原蛋白和细胞提取物中的可溶性胶原蛋白（酸或酸/胃蛋白每）。由于组织中成熟胶原蛋白的提取效率非常低，因此该方法不太适合测量组织提取物中的胶原蛋白。
QuickZyme总胶原蛋白测定
该分析可识别所有类型的胶原，无论其形式如何（成熟、未成熟、前胶原、降解胶原、交联胶原、各种来源的胶原）。
该分析为比色法，采用96孔板格式，并基于羟脯安酸的定量，羟脯氨酸是一种仅存在于胶原蛋白中的氨基酸。含胶原蛋白样品经酸水解后，羟脯安酸从胶原蛋白中释放出来。水解在950C下进行，产品可直接用于羟脯安酸分析，无需洗涤或干燥步骤。该分析基于已建立的氯胺T/DMBA方法。
用途：该方法用于测定总胶原蛋白。这包括所有胶原类型和形式，例如：前胶原、未折叠胶原、成熟胶原以及样品中所有胶原类型的胶原降解产物。由于第一步是样品的*水解，提取胶原蛋白的困难不起作用。该分析适用于各种类型的样品，包括组织。

QuickZyme敏感组织胶原测定
用羟脯安酸比色法测定组织样本中的胶原蛋白时，一个常见的并发症是出现所谓的基质效应，这是由样本中未识别的成分引起的。矩阵效应可能导致错误的高值或低值。可以通过稀释样品来防止基质效应。然而，这种稀释会导致样品的有效灵敏度较低，这对于小型
胶原蛋白含量低的样品。
与其他基于羟脯氨酸的分析相比，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析没有基质效应，也不需要稀释水解物，从而能够在低胶原蛋白浓度的小样本中进行测量。该方法简单，不需要酸水解后的干燥步骤，通常需要特殊设备。
应用：该方法用于测量组织样本中的胶原蛋白，尤其是低胶原蛋白含量的组织，如肝脏。
QuickZyme羟脯安酸测定
该测定方法与总胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与总胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的水解方法或收集水解样品进行分析的客户。
QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定
该测定方法与敏感组织胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与敏感组织胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己水解方法或收集水解样品进行分析的客户。