双荧光素酶报告基因检测试剂盒(高敏型)说明书
产品详情
货号
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规格
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价格
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78EA10009-100T
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100T
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¥1,440.00
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产品描述
报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控,萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence),这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围,同时检测的灵敏度高,可达到 10-20mol。两种催化反应最适浓度不同,因此互不干扰,配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统,其中海肾萤光素酶常作为内参照。
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为 61 kDa 的蛋白,在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下,催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin,在此过程中会产生发射波长 560 nm 的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kDa的蛋白,在氧气存在条件下,催化腔肠素(Coelenterazine) 氧化成 coelenteramide,在此过程中会发出波长约为 480 nm 的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时,可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化 luciferin 的发光,而不干扰海肾萤光素酶的活性,从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或) 或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系,可以高效、灵敏地检测目的基因的表达。
产品组分
名称
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规格
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保存条件
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5x Universal lysis Buffer(ULB)
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20 mL
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-20℃
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Fluc Buffer A
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5 mL
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-20℃
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Fluc substrate
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干粉
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-20℃
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Rluc Buffer B
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5 mL
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-20℃
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50x Rluc substrate
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100 μL
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-20℃
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使用方法
使用方法
1. 试剂准备:
(1)1x Universal lysis Buffer 配置:取所需体积的 5x Universal lysis Buffer 临用前用三蒸水稀释至 1x 用;
(2)Fluc buffer A 工作液:试剂盒开启时,将 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate中,适当吹打摇匀至粉末充分溶解后分装到棕色管中-20℃保存备用;
(3)Rluc Buffer B 工作液:临用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀释至 1x 用(按需配置),配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 内使用有效。(试剂配置过程中注意避光)
2. 细胞裂解物制备:
弃去培养板中的培养液,加入足量 PBS 清洗一遍,细胞刮刮取收集沉淀(如为悬浮细胞直接离心弃上清收集沉淀)。细胞沉淀可-80℃保存,也可立即加入适量 1x Universal lysis Buffer 吹打混匀,液氮冻融三次,制备细胞裂解物。
细胞裂解液推荐使用量:
细胞培养板
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24孔板
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12孔板
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6孔板
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1x Universal lysis Buffer(ULB)
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40 μL
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60 μL
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100μL
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3. 萤光数值检测:
(1)荧光酶标仪设定, 选择生物发光检测功能,根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积 分时间,默认为增益 135,积分时间 10 s。
(2)检测:
1) 移液枪吸取细胞裂解液 20 μL 到黑色孔板底部(充分混匀裂解物);
2) 加入 100 μL Fluc buffer A,移液器轻柔快速吹打混匀三次,立即启动检测,记录发光值 (F 值);
3)加入 100 μL Rluc buffer B,移液器轻柔快速吹打混匀三次,立即启动检测,记录发光值(R 值)。(因手动控制检测会导致时间误差较大,对结果有一定的影响,建议配备计时器,保证不同 样本之间反应和检测时长基本一致)
4.数据分析:
(1)实验设计:根据实验目的,每组实验均应设置空白对照组,对照组和处理组。
a.空白对照组
背景 F:未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。
背景 R:未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。
注:空白对照组样品量须与实验样品量相同,且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。
b. 对照组:转染细胞未经实验因素处理 (即对照组 F 和对照组 R)。
c. 实验组:转染细胞经实验化合物处理 (即实验组 F 和实验组 R)。
计算结果:对照组比值=(对照组 F-背景 F)/(对照组 R-背景 R),
实验组比值=(实验组 F-背景 F)/(实验组 R-背景 R)。
表达倍数=实验组比值/对照组比值。
图 2.荧光素酶报告基因检测试剂盒操作示意图
实验案例分析
在六孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态,第二天用新鲜的空白培养基饥饿细胞 4h 后共转三个质粒:
1.含有法尼醇 X 受体(FXR)启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒;
2.含有 FXR 启动子区转录因子 E2 功能区的表达载体质粒;
3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染 6h 后更换为含有不同药物浓度的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)和奥贝胆酸(Ocaliva,OCA)和Complete culture solution培养细胞 48h,最后按试剂盒说明书操作刮收沉淀,随后立即裂解进行荧光素酶报告基因活性检测,结果如下:
图 3(左)两个浓度(10μM,20 μM)CDCA 药物处理下,FXR 启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图;
(右)两个浓度(10μM,20 μM)OCA 药物处理下,FXR 启动子区荧光素酶报告基因激动倍数图
(红色:金畔生物品牌产品测定结果;黄色:进口“P“品牌产品测定结果)。
注意事项
(1)反应温度:酶促反应对温度较为敏感,加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温(20-25℃)。
(2)检测仪器:能检测化学发光的仪器都适用,但由于不同仪器的设置和灵敏度不同,测得的光信号值也会不同。
检测板:为防止孔间干扰,推荐使用不透光酶标板。
(3)发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响,应确保同组内不同样本检测条件一致。
(4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套。
(5)本产品仅作科研用途!