上海金畔生物INCYTO C-WellTM技术指南
使用INCYTO C-WellTM的通用、高通量和大小可控的细胞球体培养方案
一般信息
本指南的目的：
C-WellTM技术指南包含有关C-WellTM细胞球体培养平台的信息。本指南提供了球体形成和试剂制备的完整方案。
储存和有效期：
室温下储存时，C-WellTM的有效期为36个月。
不要重复使用，否则会遇到以下问题：污染、细胞球体形成失败和富含蛋白质的表面。
请勿将C-WellTM储存在紫外线辐射环境中。
预期用途：
仅供研究使用。不适用于人类或动物的诊断或治疗用途。
C孔描述TM
C-WellTM：
C-WellTM是一个革命性的细胞球体培养平台，以高通量的方式生成各种类型的尺寸控制的细胞球体。使用培养细胞球体的技术是一种悬滴法。
每个悬滴中的环境聚集细胞，然后形成单个球体。但悬滴法有几个局限性。悬滴法的主要局限性是：“劳动强度”、“低通量”、“培养时间相对较短”、“无法获得额外的新鲜生长培养基”和“细胞球体大小不均匀”。
与悬滴法相比，C-WellTM具有以下优势
任何其他商业化球体培养平台：“由于易于获得培养基更换，延长培养期10-30天”、“通过控制细胞接种密度，某些应用的培养期极短，为2-3天”、“无直接细胞-细胞接触的共培养准备系统，例如Transwell小室”、“生成尺寸受控的细胞球体”、“由于无剪切应力结构，易于改变装置中的生长培养基”、“适用于各种细胞类型”和“无限通量（一个装置可获得361个细胞球体）”。
方法
使用C孔制备用于细胞球体培养的试剂和材料TM
- 靶细胞生长培养基
- 胰蛋白酶/EDTA或ACCUTASETM
- 台盼蓝
- 磷酸盐缓冲液(PBS)1X
- 70%乙醇
- 100%乙醇
- 去离子水(DDW)，可选
- 牛血清白蛋白(BSA)4%溶液，可选
使用C孔制备细胞球体培养设备TM
- C-WellTM
- 锥形管（15 mL或50 mL）
- T75烧瓶或细胞培养皿
- 细胞过滤器（100 μm孔径）
- 皮氏培养皿（60 mm或100 mm，未处理）
- 血细胞计数器（例如DHC-N01、INCYTO）
- 移液器和吸头（1 mL和200 μL）
- 血清移液器及吸头(10 mL)
- 洁净工作台
- CO2培养箱
- 相差显微镜检查
- 吸引器
- 离心机
- 酒精灯
A. C孔预处理TM 细胞接种前
- 将生长培养基、1X PBS（或DDW）和100%乙醇加热至室温。
生长培养基的推荐近似体积为14 mL/1器械，1X PBS为24 mL/1器械，100%乙醇为8 mL/1器械。
- 在超净工作台中拆除C-WellTM的包装。
- 使用无菌镊子，从一个外缘朝向另一个外缘将C-WellTM置于60 mm培养皿上，以防止C-WellTM和培养皿之间产生气泡。
- 向制备的平皿中加入8 mL 100%乙醇。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 在培养皿一角抽吸100%乙醇。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
- 向培养皿中加入8 mL 1X PBS，再次去除气泡。
- 在培养皿一角抽吸1X PBS。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
- 重复上述7、8步两次。
- 向培养皿中加入7 mL生长培养基，并充分去除气泡。
- 将培养皿置于培养箱中至少24小时。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 在培养皿一角吸出生长培养基，并在细胞接种前加入7 mL新鲜生长培养基。
B-1.靶细胞单细胞悬液的制备（贴壁细胞用）
- 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液预热至37 ℃。
- 加入10 mL 1X PBS，轻轻清洗细胞培养瓶(T75)或培养皿(100 mm)。
- 吸取1X PBS溶液。
- 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，并将烧瓶置于37℃CO2培养箱中1 ~ 2 min（取决于细胞类型）。
- 轻轻敲击烧瓶，观察细胞。大部分细胞应分离
- 用4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液。
- 通过反复移液*分离细胞。
- 用血细胞计数器计数细胞数量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
- 在适当离心力下离心细胞悬液。
- 通过抽吸去除上清液。
- 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。
B-2.靶细胞单细胞悬液的制备（用于悬浮细胞）
- 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液（可选）加热至37 ℃。
- 通过反复移液使细胞悬液均质化并解聚。
- 用血细胞计数器计数细胞数量（例如INCYTO C-Chip、DHC-N01）
- 在适当离心力下离心细胞悬液。
- 通过抽吸去除上清液。
- （可选）加入1 ~ 2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，置于37 °C CO2培养箱中1 ~ 2 min（细胞类型不同）。
- （可选）用2 ~ 4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液（因细胞类型而异）。
- （可选）在适当离心力下离心细胞悬液。
- （可选）通过抽吸去除上清液。
- 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。
- 使用C-Well形成细胞球体TM
- 将生长培养基加热至37 ℃。
- 用1 mL移液器反复移液，轻轻去除微孔中的气泡。
- 吸出培养皿一角的生长培养基，加入7 mL细胞接种密度为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL的细胞悬液
- 10 ~ 15 min后（因细胞类型而异），轻轻吸出细胞悬液，除去上清液细胞。
- 在培养皿一角加入7 mL生长培养基。
- 吸出混悬液，并在培养皿一角加入7 mL生长培养基。重复该步骤两次。确保该步骤结束时没有悬浮细胞是非常重要的。如果不是，这些悬浮细胞可能阻碍细胞球体的形成。
- 培养皿置37 °C CO2培养箱中孵育24小时。
- 每24小时更换一次培养皿中的生长培养基。
图1 MCF7球体的培养条件。细胞接种密度和清洗时间因细胞类型而异。应通过预实验确定适当的接种密度和洗涤时间。
图2 MCF7球体的形成。
图3 A549球体的形成。
图4 HepG2球体的形成。
图5小鼠神经干细胞(mNSC)球体的形成。与其他传统的球体培养方法相比，C-WellTM可以生成尺寸控制、形状均匀的细胞球体。
- 从C孔中分离细胞球体TM
- 将生长培养基加热至37 ℃。
- 用移液器直接吸取（带1 mL吸头）生长培养基至C-WellTM上。
- 重复上述步骤2，直至收集到大部分细胞球体。
- 轻轻移取细胞球体溶液。
- 将溶液添加到细胞过滤器的一个表面（顶部）。
- 翻转滤网，并将生长培养基添加到滤网的另一面（底部）。
- 将细胞球体铺板于未经处理的培养皿中。