[实际上，这张表只有答案，没有问题。]

Klentaq1 是 Taq DNA 聚合酶的 Klenow 片段类似物。它是已知的最热稳定的 Taq 形式，它没有任何外切核酸酶或内切核酸酶，并且其晶体结构是已知的 [4]。

LA PCR 是长而准确的 PCR [1]。

根据美国 5,436,149，后缀 LA 表示已混入少量校对酶。

KlentaqLA (KTLA) 或 TaqLA 或 TthLA 是高温下进行长 DNA 延伸的最佳酶，例如引物定向诱变、长 PCR 或高保真 PCR，或用 PCR 产物引发（大引物）。（这些“酶”实际上是混合物，美国 5,436,149，由 Wayne Barnes 发明，现在由日本 Takara BIO, Inc. 所有）。

– 观看此空间以了解我在保真度方面的改进。

– TaqLA 由 Boehringer-Mannheim 出售为“Expand”，Takara Shuzo 出售为“ExTaq for LA PCR”，Life Technologies 出售为“Elongase”。

– Perkin Elmer 以“Tth XL”出售 TthLA，Clontech 以“Advantage Tth”出售 – Stratagene 的“TaqPlus”和“Taq Extender”也申请了美国 5,436,149。

“LA 技术”是将两种耐热酶混合在一起以获得更长、更准确（更高保真度）的 DNA 延伸的概念，通常用于 PCR。由 Wayne M. Barnes、美国 5,436,149 和国外同行发明。该现在归 Takara Shuzo 所有

以下两种推荐的缓冲液都假定您添加的 dNTP 和它们自己的（等摩尔）镁。如果您要添加 250 uM 每个 dNTP，请添加额外的 1 mM 镁（最终 3.5 mM）以实现此目的。
我们通过储备 10 mM 每个 dNTP、40 mM MgCl2（“10/40”）来做到这一点。然后，以下缓冲液将在 1X 时提供最佳的“过量”镁。[您可能更愿意在下面添加额外的 10 mM MgCl2，然后添加不含 Mg

的 dNTP。] Tris-HCl 原液由 Trizma Base 和 HCl 制成，浓度为 1 M Tris。然而，在室温下以 50 mM 在其他普通水中读取 pH 值。

* Klentaq1、KlentaqLA 和 Taquenase 的 10xKLA 为

* 500 mM Tris-HCl pH 9.2；160 mM 硫酸铵；25 毫米氯化镁；1% 吐温 20。

* Taq 和 TaqLA 的 10xTLA 相同，但只有 7.5 mM MgCl2。

* 包括用于高 GC 目标和多重 PCR 的最终 1.3 M 甜菜碱。还将加热步骤减少到 92-93 度。C. [从参考修改。2 & 5]

我们的“基准强度”Klentaq1、KTLA 和 TAQUENASE 相当于 wt Taq 的活性，如果它们用于 2 kb 的扩增。也就是说，0.1 ul 正好适合 50 ul 的反应大小。（野生型）Taq 的其他供应商将此称为 5 单位/ul；我们称其为“5 个 2kb-PCR 单元”/ul。更长的目标需要更多的 Klentaq1，最大为 0.65 ul/50 ul（目标大小为 35 kb；需要 KTLA 而不是 Klentaq1）。对于小于 2 kb 的目标，需要更少的 Klentaq1（但 0.1 ul 仍然可以）。

对于 2 kb 以下的 PCR 目标，如果延伸温度降低到 60 度，则需要 1/2 的酶（TaqLA 或 KlentaqLA）。并且延伸时间有所增加（即从 5′ 到 8′ 或 10’）。

Klentaq1 适用于短 PCR、RAPD 等。对于循环测序，它非常出色，但与 Taquenase 相比，它现在是旧技术。

KlentaqLA 是否在其 PCR 产物上留下钝端？部分是，部分不是。Klentaq1 确实添加了额外的 A。然而，要有效地做到这一点，需要一个额外的最后延长时间（20-30 分钟）。混合物中的校对
酶预计会去除这个额外的 A。哪一个获胜可能取决于您的 PCR 反应在完成
循环后得到的确切处理。可能性是
：4度过夜。
湾。25度吃午饭。
C。68度的咖啡。
d。上述任何一项，然后在 25 度时打个电话。
e. 上述以外。
– 我是否完成了上述实验条件，然后检查了
DNA 的末端？否。
– 我是否将我的产品克隆到平端载体中？是的，在 T4 DNA 聚合酶的钝端连接过程中使用 1 mM 六氨合氯化钴和 1 mM DTT。
– 我检查过整个克隆位点的阅读框吗？不是通过测序。
– 我是否曾经将 KlentaqLA 制造的阅读框关键 PCR 产物克隆到 ORF 的钝端？是的，根据编码产物的酶活性，大约一半的克隆似乎没有问题。
– 我用过 T 向量吗？不。

我们有数据表明 Taquenase 是循环测序的最佳酶。它必须与 MnSO4（除了 MgCl2）一起使用以获得最佳结果（Barnes，未发表）。不幸的是，由于和许可问题（见下文），您无法使用它。

1.25 M 甜菜碱（Sigma 编号 B-2629）也是一个不错的主意，可包含在循环测序反应中 [Barnes，未发表]

“Taquenase”(tm)是两种Taq突变体的组合。突变体 1 是 N 端缺失 Klentaq1（美国 5,436,149 和其他国家正在申请中。突变体 2 是由 Stan Tabor [3] 发现的 F667Y。F667Y 突变允许 ddNTP 减少 100 到 1000 倍才能正常工作。截至 3 月 25 日， 1997 年，这种突变被授予 Tabor & Richardson 并给 Amersham 的美国 5,614,365 涵盖。因此，除非我们获得 Amersham 的许可，否则我们无法提供这种酶，这是意料之中的。

我们认为没有涉及循环测序的（由 M. Craxton, MRC Cambridge, England 发明），也不是双脱氧测序（由 Fred Sanger, MRC Cambridge, England 发明）

。ddNTP 的意思是“双脱氧 NTPs”或“双脱氧终止子”。

NTP是指三磷酸核苷，聚合酶的组成部分。它们可以是 ATP、GTP、CTP 或 UTP==TTP。对于 RNA，有时为了清楚起见会添加前缀 r，例如 rCTP。对于 DNA，通常会添加前缀 d，例如 dATP。

双脱氧是指没有 OH 基团的两个位置（2′ 和 3′ 位置）。

Perkin Elmer 最近将其荧光 ddNTP 的价格（通过降低浓度）提高了 1000 倍。

DYE-ddNTP 的意思是“DYE 终止剂”或 DYE-双脱氧终止剂，它会变得很拗口。它们由 ABI 销售，但它们最初是由 Dupont 发明的，可从其子公司 NEN 获得，或即将推出。

DYE 是指荧光标记，由测序仪上的激光束激活。

Klentaq1 是已知的稳定的 Taq DNA 聚合酶形式，在 98 或 99 度的加热步骤中通过 PCR 测试。Taquenase 保持这种热稳定性。由于 Thermo Sequenase 是含有 7 个额外氨基酸的 Taquenase，我们相信它也具有这种更高的热稳定性。