1. 试剂盒简介
PHAGOTEST试剂盒，用于定量检测全血中白细胞吞噬功能。试剂盒中包括FITC荧光标记的调理大肠杆菌，细胞发生吞噬作用对FITC标记的大肠杆菌进行摄取。采用流式细胞仪测定具有吞噬功能的细胞（粒细胞和单核细胞）总百分以及细胞的吞噬活性（每个细胞吞噬的细菌数目）。
试剂盒可以考察药物是否引起机体细胞吞噬作用改变。异常的吞噬作用通常会发生在多种临床疾病，例如，中性粒细胞自身缺陷，免疫球蛋白及补体缺陷等。先天性缺陷，例如白细胞整合素缺陷，肌动蛋白功能障碍等，均会到导致感染的风险增加以至于引起中性粒细胞吞噬功能的缺陷。获得性缺陷相关的吞噬作用的改变通常发生在外科创伤，糖尿病，肾衰竭，全身性感染和急性胰腺炎等。吞噬功能的降低还会发生在烧伤感染的病人，AIDS病人，老年人，新生儿，采用糖皮质激素或者麻醉药治疗的病人等。
在一些体外或者体内试验中，可以观察到多种免疫调节剂，例如白介素-2，干扰素-γ，植物提取素等可以增强中性粒细胞和单核细胞的吞噬功能。
试剂盒不仅适用于人的血样，同样也适用于大小鼠，兔，狗，牛及其他种属。
2. 材料和试剂
2.1 试剂盒包括以下试剂
 REAG A（ 试剂A）
1x洗液：将1整瓶REAG A粉末溶解在1L的双蒸水中。
 REAG B（试剂B）
1瓶（2mL），1x浓度的稳定且用FITC标记的调理大肠杆菌（E.coli），大约2×109个菌/mL。
 REAG C（试剂C）
1瓶（10 mL），1x浓度的淬灭溶液，用于淬灭在细胞外的细菌荧光表达，蓝色溶液。
 REAG D（试剂D）
1瓶（20 mL）的裂解液（10x储备液浓度）。在使用前用双蒸水按1:10进行稀释，配制成1x的裂解液，用于裂解红细胞和固定白细胞。
 REAG E（试剂E）
1瓶（20 mL），1x浓度的DNA染液（粉色溶液），用于流式细胞仪分析时区别细菌和白细胞。

储存条件和稳定性：试剂盒需要在2-8℃避光条件。使用前将大肠杆菌（REAG B）充分涡旋混匀或者用针抽吸使其分散。试剂内含有防腐剂，但是不会吞噬功能的检测。试剂的有效期同试剂盒包装上标明一致。
2.2 试剂盒未包括以下材料，但需要准备
 血液采集用的肝素化抗凝管。
 12×75 mm的一次性试管（BD公司的Falcon管，货号：352052）和合适数量的试管架。
 500 mL和1000 mL的试剂瓶，用于保存1x洗液和1x裂解液。
 带盖的冰浴盒。
 双蒸水或者注射用水，用于配制1x洗液和1x裂解液。
 合适量程的移液器（20-200 μL, 100-1000 μL），一次性枪头。
 连续加样器和枪头。
 水浴锅。
 数字式温度计。
 涡旋器
 冷冻离心机（配有12×75 mm的吊杯）。
 488 nm激发波长（氩离子激光）的流式细胞仪。
3. 操作过程
2.1 准备
 配制1x洗液。
 根据测试的样本量配制1x裂解液（试剂D）， 2mL/测试样。
 准备冰浴。
 预热水浴锅至37℃，温度必须控制！
 开启流式细胞仪，用校准微球（beads）进行校准。
3.2 样本处理
3.2.1 加样
将肝素化抗凝的全血涡旋混匀后，在5 mL试管（Falcon管）底部各加100 μL全血。一般取2支试管，其中1支为阴性对照管，另1支为测试管。将所有试管放入冰浴中10 min，使血样降低温度至0℃。
注意：勿将血液残留在试管壁上。不要使用EDTA或者柠檬酸抗凝管采集全血。
3.2.2 激活
涡旋混匀已经预冷的大肠杆菌（REAG B），每支试管（即阴性对照管和测试管）中均加入20 μL的REAG B。
3.2.3 孵育
所有试管再次混匀后，阴性对照管置于冰上；测试管则置于37°C水浴中，孵育10 min。孵育时间和温度必须严格监控，水浴箱必须盖住
3.2.4 淬灭
孵育结束后，将同一试管架上所有样本同时拿出水浴箱，放置于冰上阻止吞噬过程，在所有试管加入100 μL冰冷的淬灭溶液（REAG C），冰上操作，涡旋混匀。
3.2.5 洗涤
每支试管加入3 mL 1x洗液（REAG A），涡旋混匀，离心细胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
再洗一次。每支试管加入3 mL 1x洗液（REAG A），涡旋混匀，离心细胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.6 裂解和固定
每支试管加入2 mL预热至室温的1x 裂解液（REAG D），涡旋混匀，室温避光孵育20 min。离心（5 min，250xg，2-8°C），去除上清液。
3.2.7 洗涤
每支试管加入3 mL 1x洗液（REAG A），涡旋混匀，离心细胞（5 min，250xg，2-8°C）。去除上清液。
3.2.8 DNA染色
每支试管加入200 μL DNA染液（REAG E），混匀，避光冰浴10 min后，在60 min内完成流式细胞仪分析。
4. 流式细胞仪分析
采用蓝绿激发光的488nm的氩离子激光器。
 设定1个gate在FL2的直方图（红色荧光），圈定含有人类二倍体细胞相同DNA的细胞群（用于排除细菌，见英文原版图Fig. A）
每个样本收集10,000-15,000 白细胞。
 数据评估
对发生吞噬作用细胞（粒细胞和单核细胞）的百分比和其平均荧光强度（细胞吞噬细菌数量）进行分析。在散点图 lin FSC/lin SSC中圈定所要检测细胞群（粒细胞，单核细胞），见英文原版图Fig.2A，2C；并对其绿色荧光强度的FL1的直方图进行分析，见英文原版图Fig.2B，2D。
阴性对照管（在FL1坐标轴上设定maker，使1~3%的细胞在阳性区域。
测试管中发生吞噬作用的细胞显示在marker内，为的阳性细胞，平均荧光强度与每个白细胞吞噬的细菌数量相关。
5. 注意事项（Remarks）
 肝素化抗凝的全血需要在采集后24 h进行处理，在处理前在室温条件下保存。
 嗜酸性粒细胞（过敏及寄生虫感染时数量增多）显示自体荧光增长，在0°C 时的阴性对照分析会被显示出来。
 吞噬细胞在37°C的大小和颗粒度会与阴性对照的样本不同，这一点在圈定细胞区域的时候要注意。另外，细胞可能会由于在37°C条件下的自体溶解或者粘附在塑料表面而丢失减少。
 在建立试验方法时，采用重复管是非常有用的。
 提供的试验方法是在*条件下（如，调理的大肠杆菌等）考察样本的吞噬功能。在正常人体给药后进行体内或者体外吞噬功能检测时通常只有一定程度增加。
进行体外试验检测药物作用时，可进行时间依赖性动力学试验（与大肠杆菌孵育2.5或者5 min）或者稀释菌液（1：4或者1:8）
 大肠杆菌已经受调理素的作用过的，但是全血中的血清还会对其有一定的影响。所以当采用除全血样本以外的样本，如HL-60 （人早幼粒白血病细胞），分离的单核细胞，巨噬细胞与大肠杆菌孵育时，孵育体系可加入5-20% 胎牛血清或者人血清。同时也可能有必要延长孵育时间（60 min-240 min）。
 未受调理素作用的FITC标记的大肠杆菌（REAG F，试剂盒未包括），可用于检测病人血清使细菌受调理素作用的能力。
6. 其他限制（Limitations）
 每个实验室需要根据自己实验条件建立的自己的参考值范围。
 样本需要至少有95%的活细胞且需要*被抗凝。含有衰老的细胞和未*抗凝的血样可能导致非特异染色，可能是由于血小板的凝集和死细胞的泄漏的DNA引起的。
 大肠杆菌（大约4 x 107/20μL）与白细胞（在100 μL全血）的比例为50:1（假设白细胞为8000个/μL），比例为80:1（假设白细胞为5000个/μL）。当样本的白细胞数量与正常范围不同时（4000-10000）需要根据其数量加入相应数量的大肠杆菌。
 样本在未加入DNA染液（REAG E）上流式细胞仪检测前，在冰上放置24 h是稳定的，但是荧光强度会系统性的丢失。
7. 关于进行定量分析的重要的说明（important instruction for quantitative analysis）
 吞噬过程是主要依赖于温度，所以在整个样本处理过程中样本的温度，孵育条件的温度是需要严格遵守。温度计应采用可以显示小数点后一位的型号。
 实验的可重复性和标准化操作是非常重要的，所以需要严格按照试剂说明书和自己改动步骤（如果有改动）进行操作。
 任何流式细胞仪的改动都要考虑，因为这会影响到“Geomean”的值，所以使用校准微球（beads）对流式细胞仪进行每日的校准是非常有必要的。